Proc Natl Acad Sci EUA A. Jan 19, 2010; 107 (3): 1217 – 1222.
Publicado online Dec 29, 2009. doi: 10.1073 / pnas.0911998107
PMCID: PMC2824263
Neuroscience
Yan Liu,a,b Brandon J. Aragona,c Kimberly A. Young,a,b David M. Dietz,b,d,e Mohamed Kabbaj,b,d Michelle Mazei-Robison,e Eric J. Nestler,e e Zuoxin Wanga,b,1
Este artigo foi citado por outros artigos no PMC.
Sumário
A ratazana da pradaria (Microtus ochrogaster) é uma espécie de roedor socialmente monogâmica que forma pares de ligações após o acasalamento, um comportamento no qual a dopamina central (DA) tem sido implicada. Aqui, usamos machos da pradaria para examinar os efeitos da exposição à droga na união de pares e circuitos neurais relacionados. Em nosso primeiro experimento, o comportamento motivado por anfetamina (AMPH) foi examinado usando um paradigma de preferência de lugar condicionado (CPP) e mostrou-se mediado pela ativação de receptores DA semelhantes a D1. Em seguida, examinamos os efeitos da exposição repetida a AMPH na ligação de pares. Os machos controle pré-tratados com solução salina e intacta apresentaram preferências de parceiros induzidas pelo acasalamento, enquanto os machos pré-tratados com AMPH nas doses efetivas para induzir CPP falharam em mostrar as preferências dos parceiros induzidas pelo acasalamento. Esse tratamento com AMPH também melhorou a expressão do receptor D1, mas não D2, DA no nucleus accumbens (NAcc). Além disso, o bloqueio farmacológico de receptores DA do tipo D1 nas preferências de parceiro induzidas por acasalamento resgatadas pelo NAcc em homens tratados com AMPH. Juntos, nossos dados indicam que a exposição repetida a AMPH pode estreitar o repertório comportamental de ratos machos da pradaria através de um mecanismo específico do receptor DA no NAcc, resultando no comprometimento da formação de ligações em pares.
É amplamente aceito que os comportamentos motivados e emocionais que promovem o condicionamento físico são regulados por circuitos de recompensa do cérebro, incluindo o sistema de dopamina mesolímbica (DA) (1, 2). Embora este sistema esteja frequentemente implicado na ingestão de alimentos e no comportamento sexual (3, 4), também tem sido implicado em outros comportamentos motivados que ocorrem naturalmente, como jogos sociais entre jovens e laços sociais entre pais e filhos (5-9). Freqüentemente subrepresentados em pesquisas estão os laços sociais formados entre parceiros adultos, isto é, ligações de pares. Investigação recente utilizando uma espécie de roedor socialmente monogâmica, a ratazana-da-pradaria (Microtus ochrogaster) (10-12), indicam que uma grande parte da regulação neural subjacente à formação e manutenção de ligações em pares ocorre dentro do nucleus accumbens (NAcc) (13-15) - uma região cerebral mesolímbica crítica para a mediação de comportamentos motivados (1, 2, 16).
Embora os circuitos motivacionais tenham evoluído para promover o comportamento de melhora da aptidão, como alimentação, acasalamento e vínculo social (1, 17), é vulnerável à usurpação artificial por drogas de abuso (8). Por exemplo, a administração de drogas psicoestimulantes de abuso, como cocaína e anfetamina (AMPH), resulta em alterações persistentes da atividade da DA mesolímbica (18, 19). O intenso impacto neste circuito por estes e outros fármacos viciantes tem sido sugerido para diminuir o valor percebido dos incentivos naturais (20), incluindo os de natureza social (8). Embora se saiba que os viciados em drogas apresentam comportamento social prejudicado (21), a regulação neural das interações entre a experiência de drogas e a ligação social é pouco compreendida. Isso ocorre porque, em parte, essas interações são difíceis de serem modeladas em roedores de laboratório tradicionais que não exibem vínculo social entre os membros adultos.
A neurobiologia de tal apego social, especificamente a ligação entre pares entre adultos, tem sido extensivamente estudada na ratazana das pradarias (10-12), e recentemente, esta espécie foi estabelecida como um modelo viável para examinar o valor motivacional da AMPH (22). Além disso, tanto a formação de ligações de pares quanto o reforço de AMPH são mediados, pelo menos em parte, pela transmissão de DA dentro do NAcc (14, 15, 23). Portanto, o presente estudo utilizou o modelo ratazana-da-pradaria para estabelecer um ensaio comportamental para estudar os efeitos da exposição à droga na ligação social e focou no sistema de sinalização NAcc DA para revelar um mecanismo neural subjacente a esses efeitos comportamentais.
Consistentes
A preferência de lugar condicionada induzida por AMPH (CPP) é mediada por DA de uma maneira específica para o receptor.
A formação de CPP foi definida por um aumento significativo no tempo gasto na gaiola pareada com AMPH durante o pós-teste, após 3 dias de condicionamento AMPH, em relação ao pré-teste. Nem as injecções salinas nem a solução salina contendo as duas doses mais baixas de AMPH testadas (0.1 e 0.5 mg / kg) alteraram as preferências da gaiola (FIG. 1A). No entanto, os homens foram condicionados com doses mais elevadas de AMPH, incluindo 1.0 (t = 2.87, P <0.01), 3.0 (t = 3.63, P <0.01), ou 5.0 mg / kg (t = 3.03, P <0.01), CPP exibido (FIG. 1A).
Porque a AMPH aumenta significativamente a neurotransmissão de DA em ratos da pradaria (24), e DA media o reforço de AMPH em outras espécies (23), em seguida, examinamos a regulação do receptor DA (DAR) da CPP induzida por AMPH em ratos machos da pradaria. Os sujeitos foram pré-testados no paradigma CPP, tratados com solução salina ou salina contendo diferentes doses do antagonista de DAR não selectivo (haloperidol) antes de injecções de AMPH (1.0 mg / kg) durante 3 dias de condicionamento e depois testados para CPP num pós-teste. Sujeitos tratados com solução salina (t = 2.69, P <0.01) ou solução salina contendo as duas doses mais baixas de haloperidol (0.1 mg / kg; t = 3.62, P <0.01; 1.0 mg / kg; t = 3.89, P <0.01) antes do condicionamento de AMPH exibir CPP induzido por AMPH, enquanto haloperidol a 5.0 mg / kg bloqueou o CPP induzido por AMPH, mostrando o envolvimento de DARs nos efeitos comportamentais de AMPH (FIG. 1B). Para determinar qual subtipo DAR medeia a CPP induzida por AMPH, em seguida administramos um antagonista específico do tipo D1 (SCH23390) ou um antagonista específico do tipo D2 (eticlopride) antes das injeções de AMPH durante o condicionamento. O antagonismo do tipo D2 não bloqueou a CPP induzida por AMPH (t = 3.15, P <0.01 para 0.5 mg / kg e t = 2.60, P <0.05 para 5.0 mg / kg de eticloprida), mas o bloqueio dos receptores semelhantes a D1 eliminou o CPP induzido por AMPH (FIG. 1B), demonstrando que a CPP induzida por AMPH é mediada pela ativação de receptores do tipo D1, mas não do tipo D2, em proles masculinos de pradaria.
A Experiência AMPH Altera a Formação de Preferência de Parceiro Induzida por Acasalamento.
Embora a CPP induzida por AMPH exigisse a ativação de receptores semelhantes a D1 (FIG. 1B), mostrámos anteriormente que a activação de receptores do tipo D1 impede a formação de ligações de pares induzida pelo acasalamento (14). Portanto, nós hipotetizamos que o pré-tratamento com AMPH interferiria na ligação pareada induzida pelo acasalamento em machos da pradaria masculina. Os machos foram divididos em quatro grupos que não receberam injeções (intactas), injeções salinas ou injeções de 1.0 ou 5.0 mg / kg AMPH por 3 dias (um paradigma de injeção suficiente para induzir CPP). No quarto dia, todos os machos foram pareados com uma fêmea sexualmente receptiva para 24 h e, em seguida, testados para as preferências do parceiro. Consistente com estudos anteriores (14, 25-27), machos e machos inteiros que receberam injeções salinas por dias 3 antes do acasalamento mostraram preferências de parceiros induzidas pelo acasalamento (machos inteiros; t = 3.05, P <0.01, machos injetados com solução salina; t = 3.21, P <0.01; FIG. 2A). No entanto, os machos que foram pré-tratados com qualquer dose de AMPH por 3 dias antes do acasalamento não mostraram as preferências dos parceiros (FIG. 2A). É importante ressaltar que o pré-tratamento com AMPH não afetou a freqüência de acasalamento durante o período de coabitação (F(3, 26) = 0.26, P = 0.85; FIG. 2B) ou actividade locomotora durante o teste de preferência do parceiro (F(3, 26)= 2.34, P = 0.10; FIG. 2C), indicando que a AMPH interferiu diretamente nas preferências dos parceiros induzidos pelo acasalamento.
A experiência do AMPH eleva os receptores D1 no NAcc.
Dado que a pré-exposição à AMPH prejudicou as preferências dos parceiros e tanto a CPP induzida por AMPH (ver acima) como a ligação pareada (14) são regulados pela NAcc DA, nós hipotetizamos que a AMPH alteraria significativamente o circuito DA mesolímbico em ratos machos da pradaria. Cérebros de indivíduos da experiência comportamental acima mencionada foram processados para marcação in situ de ARNm de marcador DA. Os machos tratados com AMPH (1.0 mg / kg) mostraram um aumento significativo no receptor D1 (D1R; t = 3.06, P <0.01), mas não o receptor D2 (D2R), marcação de mRNA dentro do NAcc, em comparação com homens que receberam pré-tratamento com solução salina (FIG. 3 A-C) No entanto, nenhuma diferença de grupo foi encontrada na densidade de marcação de mRNA para tirosina hidroxilase (TH), transportador DA (DAT) ou D2Rs dentro da área tegmental ventral (VTA) - a região do cérebro que fornece a entrada dopaminérgica primária para o NAcc (FIG. 3 D-G). O aumento da expressão de D1Rs no NAcc foi confirmado por Western blotting (t = 1.90, P <0.05; FIG. 3 H e I). Juntos, esses dados indicam que a exposição ao AMPH tem efeitos específicos do receptor e do local no sistema de DA mesolímbico de ratos da pradaria masculina - aumentando o nível de D1Rs no NAcc.
Receptores D1 no NACC Mediate AMPH Imparidade de Preferências de Parceiro.
Nós mostramos anteriormente que, em machos de pradaria macho, a ativação de D1Rs dentro do NAcc preveniu a formação de preferência do parceiro (14), e o presente estudo demonstra que a exposição AMPH regula positivamente os D1Rs no NAcc (FIG. 3). Portanto, testamos a hipótese de que o comprometimento das preferências de parceiros induzido por AMPH é mediado por D1Rs dentro do NAcc. Os machos receberam canulação estereotáxica apontada bilateralmente na concha do NAcc (FIG. 4A). Líquido cefalorraquidiano artificial (LCR) sozinho ou LCR contendo diferentes doses do antagonista do receptor tipo D1 SCH23390 foi injetado no NAcc antes de injeções de AMPH (1.0 mg / kg) durante 3 dias de condicionamento. Posteriormente, os participantes foram pareados com uma fêmea para o 24 h e, em seguida, testados para as preferências do parceiro. Como no experimento acima (FIG. 2), A exposição à AMPH impediu as preferências dos parceiros induzidos pelo acasalamento em homens que receberam injecções intra-NAcc de LCR ou uma dose baixa de SCH23390 (FIG. 4B). No entanto, os homens que foram injectados com uma dose elevada de SCH23390 (100 ng / kg) revelaram preferências dos parceiros (t = 2.55, P <0.05), indicando que o bloqueio D1R no NAcc eliminou o comprometimento induzido por AMPH da formação de preferência de parceiro (FIG. 4B). Não foram encontradas diferenças de grupo na frequência de acasalamento durante a coabitação ou atividade locomotora durante o teste de preferência do parceiro.
Discussão
Neste estudo, nós replicamos nossa descoberta anterior de que a exposição ao AMPH induz CPP em ratos machos da pradaria (22) e demonstrar que a activação do D1R no NAcc é necessária para este comportamento, um resultado consistente com estudos em outras espécies de roedores (28). Esta descoberta, juntamente com estudos anteriores, sugere que mecanismos DAergic distintos no NAcc regulam comportamentos motivados por parceiros e AMPH: o comportamento motivado por AMPH (CPP) é mediado por D1R, enquanto o comportamento motivado por parceiros (preferências de parceiros) é facilitado por D2R activação e inibição da activação D1R no NAcc (13-15). [É importante notar que, no NAcc, a ativação do D2R medeia o CPP induzido por medicamentos sob certas condições (29) e a ativação do D1R está envolvida em outros comportamentos socialmente motivados, como aqueles dirigidos à prole (7, 30)].
Diferencial A regulação dérgica da CPP e da formação de preferência de parceiros é mais provavelmente alcançada por diferenças no grau de concentração de DA evocada por estímulo, ativando diferentes subtipos de DAR. Devido a diferenças nas afinidades de ligação, elevações robustas na concentração de DA são necessárias para ativar D1Rs de baixa afinidade, enquanto aumentos modestos nas concentrações de DA preferencialmente ativam D2Rs de alta afinidade (31). Em ratos da pradaria, AMPH evoca aumentos muito maiores na concentração de DA (24) em comparação com o evocado por acasalamento (15, 25). Estes dados sugerem que aumentos relativamente modestos na concentração de DA durante as interações sociais (15, 25) permitem a ativação específica de D2Rs de alta afinidade e, assim, facilitam a formação de ligações entre pares. Por outro lado, aumentos robustos na concentração de DA após a administração de AMPH são provavelmente suficientes para ativar D1Rs de baixa afinidade, facilitando assim a CPP induzida por AMPH.
A regulação comportamental específica do receptor por DA é consistente com estudos eletrofisiológicos extracelulares em ratos em movimento livre, mostrando que o fármaco e os estímulos naturais são processados por populações neuronais distintas dentro do NAcc (32). Embora tais estudos eletrofisiológicos sejam incapazes de identificar o subtipo de receptores DA expressos em neurônios individuais, estudos anatômicos demonstram que o NAcc é constituído de neurônios de projeção que expressam D1Rs ou D2Rs com muito pouca coexpressão (33). Os psicoestimulantes ativam preferencialmente as vias de sinalização intracelular a jusante dos D1Rs (conforme determinado pelo aumento da fosforilação de moléculas sinalizadoras) (34) e já mostramos anteriormente que o aumento da ativação dessas vias de sinalização impede a formação de preferência do parceiro (35). Assim, embora a transmissão de DA no NAcc desempenhe um papel importante na resposta à AMPH e na formação de preferências de parceiros, esses comportamentos são provavelmente mediados por microcircuitos distintos que compreendem sistemas de projeção estriatal (33, 36). Isto é de particular interesse porque a formação de ligações de pares é mediada pela ativação de neurônios que expressam D2R que preferencialmente projetam para o pálidum ventral (33), outra região do cérebro importante para a união de pares (26).
Neste estudo, nós fornecemos evidências de que a experiência com AMPH previne a união de pares induzida pelo acasalamento. Como os testes de preferência de parceiros nesses experimentos foram realizados 48 h após a última exposição a AMPH (ou seja, após o medicamento ter sido completamente metabolizado), esses dados sugerem um efeito persistente da AMPH na ligação social. Um mecanismo potencial, consistente com os efeitos da AMPH em outras espécies (37, 38), através do qual a AMPH pode prejudicar a ligação de pares é através do aumento da expressão de D1R dentro do NAcc. Esta noção é apoiada pelo papel antagónico dos D1Rs NAcc na formação de preferências de parceiros (14, 24) e pelos dados actuais que demonstram o resgate da preferência dos parceiros induzidos pelo acasalamento pelo bloqueio intra-NAcc D1R nos animais tratados com AMPH (FIG. 4). Curiosamente, já mostramos anteriormente que, em machos de pradaria, a supra-regulação de NAx D1Rs após 2 semanas de emparelhamento facilita a agressão seletiva para estranhos coespecíficos, incluindo fêmeas sexualmente receptivas, sugerindo que essa plasticidade neural é um mecanismo evoluído pelo qual ratos machos manter obrigações de pares já estabelecidas (14). O presente estudo sugere que a AMPH desencadeia artificialmente essa neuroplasticidade, levando a um comprometimento da AMPH na ligação do par. Também é possível que os homens tratados com AMPH possam associar a mulher a um estado aversivo de abstinência de AMPH e, portanto, essa associação negativa pode estar por trás do comprometimento de AMPH na ligação de pares. Um estudo anterior demonstrou que a retirada de um escalonado esquema de doses de d-anfetamina prejudicava o comportamento sexual em ratos machos (39). Em nosso estudo, no entanto, ratos de diferentes grupos de tratamento exibiram ataques similares de acasalamento (FIG. 2B), indicando que eles provavelmente não estavam em estado de abstinência de anfetamina. No entanto, esta possibilidade justifica uma investigação mais aprofundada.
Está bem estabelecido que a plasticidade neural induzida por drogas é fundamental para a dependência de drogas (40). Os psicoestimulantes alteram dramaticamente a plasticidade estrutural no sistema mesolímbico DA (41) e há evidências que sugerem que tais mudanças são mais duradouras nos neurônios que expressam D1 (37). Além disso, estudos eletrofisiológicos mostraram que a experiência da cocaína pode reduzir a neuroplasticidade subseqüente dentro do NAcc (42). De fato, a reorganização neural induzida por drogas do NAcc atenua a reorganização neural natural após a nova exposição a ambientes complexos (43). Portanto, embora o vício em drogas seja amplamente reconhecido como um distúrbio de aprendizado e memória (1, 40, 44), é freqüentemente subestimado que uma perda induzida por drogas do potencial de alteração adicional nos circuitos mesolímbicos também possa ser essencial para o vício. Tal redução na plasticidade pode limitar um repertório comportamental à busca de drogas. Por isso, não é surpreendente que as ratazanas tratadas com AMPH tenham demonstrado um comportamento de ligação de pares reduzido. Os efeitos atuais da exposição à AMPH na união de pares são consistentes com estudos prévios que ilustram os efeitos deletérios dos psicoestimulantes sobre outros comportamentos sociais, incluindo o comportamento materno (45-47) e jogo social (48-50). Juntos, esse trabalho fornece a promessa de que o exame de como os estímulos sociais e medicamentos interagem no cérebro pode ampliar significativamente nossa compreensão das fortes interações entre o comportamento social e o uso de drogas em seres humanos (21).
Materiais e Métodos
Sujeito.
Os sujeitos eram machos da pradaria sexualmente ingênuos de uma colônia de reprodução de laboratório. Os indivíduos foram desmamados aos 21 dias de idade e alojados em pares de irmãos do mesmo sexo em gaiolas de plástico (12 × 28 × 16 cm) onde a água e os alimentos foram fornecidos ad libitum. Todas as gaiolas foram mantidas sob um ciclo 14: 10 claro-escuro, e a temperatura foi de aproximadamente 20 ° C. Todos os indivíduos tinham cerca de 90 dias de idade quando testados. A canulação estereotáxica e a infusão específica de local de drogas DA foram descritas em detalhes em outros lugares (14).
Teste Comportamental.
O teste de CPP foi conduzido como descrito anteriormente (22) com as seguintes exceções. A preferência inicial por gaiola para cada indivíduo foi determinada em um pré-teste 30-min no dia 1. Os indivíduos foram então condicionados, durante as sessões mínimas 40, com AMPH para a gaiola não preferida e solução salina para a gaiola preferida (AMPH e injecções salinas foram dadas no mesmo dia, 6 h separadas) durante 3 dias consecutivos (dias 2-4). Posteriormente, os indivíduos foram testados (pós-teste) para a presença de um CPP no dia 5.
O teste de preferência do parceiro foi realizado conforme descrito anteriormente (14). Resumidamente, o aparelho de teste consistia de uma gaiola central (12 × 28 × 16 cm) unida por tubos ocos (7.5 × 16 cm) a duas gaiolas paralelas idênticas, cada uma abrigando um animal de estímulo. Os animais estímulos eram o “parceiro” familiar (companheiro feminino do sujeito) e um “estranho” desconhecido (uma mulher que não havia encontrado o sujeito anteriormente) que estava frouxamente presa dentro de suas gaiolas separadas sem contato direto um com o outro. No início do teste 3-h, os sujeitos foram colocados na gaiola central e deixados a circular livremente por todo o aparelho. O comportamento foi gravado usando um sistema de gravação de vídeo com lapso de tempo. Experimentadores cegos à manipulação revisaram a fita e registraram o comportamento do sujeito. Uma preferência de parceiro foi definida como o sujeito passando significativamente mais tempo em contato lado a lado com o parceiro do que o estranho, conforme indicado por um par de amostras. t teste (27).
Hibridização In Situ e Imunoblotting Ocidental.
Ribossondas antisense específicas (tabela 1) foram utilizados para marcação de ARNm in situ de D1R, D2R, TH e DAT. A rotulagem foi realizada com 35Sondas marcadas com S e controles de mRNA de sentido para cada marcador de DA como descrito anteriormente (51). Para análise Western blotting, a proteína DAR foi extraída do sobrenadante de punções de tecido NAcc e ensaiada como descrito anteriormente (52).
Quantificação e Análise de Dados.
CPP e preferências de parceiros foram determinadas por amostras pareadas t testes. As diferenças de grupo nos encontros de acasalamento durante o primeiro 6 h de emparelhamento com uma fêmea e as entradas da gaiola durante o teste de preferência do parceiro foram analisadas pela ANOVA. As densidades �ticas da marca�o de ARNm de D1R e D2R na NAcc assim como a marca�o de ARNm de TH, DAT e D2R na VTA foram quantificadas a partir de autorradiogramas utilizando um programa de imagem computorizado (NIH IMAGE 1.64). Os dados foram apresentados como variação percentual da média do grupo controle salino e as diferenças dos grupos foram analisadas t testes. Finalmente, as densidades ópticas da marcação D1R e D2R no filme de raios X das experiências de Western blotting foram analisadas t testes.
Design experimental.
O experimento 1a estabeleceu uma curva dose-resposta para CPP induzida por AMPH. Os indivíduos foram pré-testados no aparelho CPP no dia 1, distribuídos aleatoriamente em um dos seis grupos experimentais que receberam injeções ip (ip) de solução salina contendo diferentes concentrações de AMPH [0 (n = 12), 0.1 (n = 8), 0.5 (n = 9), 1.0 (n = 12), 3.0 (n = 12) ou 5.0 mg / kg (n = 13)] durante 3 dias (dia 2 – 4) de condicionamento e, em seguida, testado para CPP em um pós-teste no dia 5.
A experiência 1b revelou os papéis dos receptores DA na CPP induzida por AMPH. Os indivíduos foram pré-testados no aparelho CPP e aleatoriamente designados em um dos oito grupos experimentais que receberam uma injeção sc (sc) de solução salina (n = 10) ou solução salina contendo diferentes concentrações de um antagonista não seletivo do receptor DA [haloperidol; 0.1 (n = 8), 1.0 (n = 8) ou 5.0mg / kg (n = 8)], ou um específico do tipo D1 (SCH23390; 0.5 (n = 7) ou 5.0 mg / kg (n = 7)] ou antagonista do receptor DA específico do tipo D2 [eticlopride; 0.5 (n = 8) ou 5.0 mg / kg (n = 8)]. Trinta minutos depois, uma dose limiar de AMPH (1.0mg / kg), que induziu CPP no Experimento 1a, foi usada para condicionamento de AMPH. Após 3 dias de condicionamento AMPH, todos os indivíduos receberam um pós-teste de CPP.
O experimento 2 examinou se a experiência com AMPH interferiu na ligação do par. Os indivíduos foram distribuídos aleatoriamente em um dos três grupos experimentais que receberam injeções ip de solução salina (n = 8) ou soro fisiológico contendo 1.0 mg / kg (n = 8) ou 5.0 mg / kg (n = 7) AMPH uma vez por dia por 3 dias consecutivos - um paradigma que induziu CPP em ratos machos da pradaria. No quarto dia, os indivíduos foram emparelhados com uma fêmea preparada com estrogénio para 24 h (14), e foram então testados em um teste de preferência de parceiro 3-h. Para controlar os efeitos potenciais de injeções na união de pares, um quarto grupo experimental de machos intactos que não receberam nenhuma injeção (n = 6) foi emparelhado com fêmeas estimuladas com estrogênio para 24 h e, em seguida, testado para as preferências do parceiro. Todos os testes comportamentais foram gravados em vídeo para verificação do acasalamento. A duração do contato lado a lado dos sujeitos com o parceiro e o estranho foram quantificados. Além disso, foram quantificadas as frequências das sessões de acasalamento durante o primeiro XnUMX h de emparelhamento e atividade locomotora (indicadas pelo cruzamento da gaiola) durante o teste de preferência do parceiro 6-h. Após o teste de preferência do parceiro, os sujeitos foram imediatamente mortos. Todos os cérebros foram colhidos, congelados em gelo seco e armazenados a –3 ° C para marcação de hibridização in situ de mRNAs do marcador DA.
O experimento 3 examinou se a ligação do par prejudicado por AMPH estava associada a mudanças na atividade da DA mesolímbica. Cérebros dos sujeitos que receberam solução salina (n = 8) ou 1.0 mg / kg AMPH (n = 8) no Experimento 2 foram cortados em um criostato em seções coronal (14 μm de espessura) que foram descongeladas montadas em Superfrost / Slides Plus (Fisher Scientific). Cortes cerebrais em intervalos de 98-μm foram processados para a marcação de hibridização in situ dos mRNAs D1R, D2R, TH e DAT. Como as ratazanas experimentadas com 1.0 mg / kg AMPH apresentaram um aumento na D1R, mas não na marcação com D2R, mRNA na NAcc, em comparação com controlos injectados com solução salina, foram gerados dois grupos adicionais de sujeitos que receberam injecções de solução salina (n = 6) ou 1.0 mg / kg AMPH (n = 6), 24 h de acoplamento e, em seguida, teste de preferência de parceiro, conforme descrito acima. Os sujeitos foram decapitados e os cérebros foram cortados em um criostato com 300 μm de espessura. Os punções teciduais retirados bilateralmente do NAcc foram processados para Western Blot D1R e D2R.
O experimento 4 examinou se a ativação dos receptores do tipo D1 no NAcc era responsável pelo comprometimento do AMPH da ligação do par. Os sujeitos foram implantados com cânula guia bilateralmente destinada à concha NAcc. Após 3 dias de recuperação, eles foram distribuídos aleatoriamente em um dos três grupos experimentais em que receberam injeções intra-NAcc de CSF (200 nL / lado, n = 11), ou CSF contendo 0.4 (n = 6) ou 100 ng / side (n = 7) SCH23390. Trinta minutos depois, receberam injecções ip de 1.0 mg / kg AMPH. Este procedimento foi repetido por 3 dias consecutivos. No quarto dia, os participantes foram emparelhados com uma fêmea preparada com estrogénio para 24 h e depois testados para as preferências dos parceiros.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Kyle Gobrogge, Claudia Lieberwirth, Kelly Lei e Melissa Martin pela leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Subsídios de Saúde MHR01-58616, DAR01-19627 e DAK02-23048 para ZW
Notas de rodapé
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Este artigo é uma submissão direta PNAS.
Referências