FACS在可选择性激活的成人纹状体神经元中鉴定出可卡因诱导的独特基因调控（2011年）–占纹状体神经元的一小部分

J Neurosci。 作者手稿; 可在PMC Sep 16，2011中找到。
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PMCID：PMC3073079
NIHMSID：NIHMS279955

 

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抽象

对神经活动标记物Fos的大量研究表明，可卡因仅激活一小部分稀疏分布的纹状体神经元。 到目前为止，还没有有效的方法来评估这些激活的神经元内特异性诱导的神经适应。 我们使用荧光激活细胞分选（FACS）来纯化在幼稚和可卡因致敏的可卡因诱导的运动过程中激活的纹状体神经元。 首席财务官-的lacZ 转基因大鼠。 用抗β-半乳糖苷酶的抗体标记活化的神经元，β-半乳糖苷酶是lacZ基因的蛋白质产物。 Cocaine在小部分活化的神经元中选择性地诱导了独特的基因表达谱，这在未激活的大多数神经元中未观察到。 这些基因包括立即早期基因的改变水平 弧，fosB及 nr4a3，以及参与p38 MAPK信号传导和细胞类型特异性的基因。 我们建议这种FACS方法可用于研究编码滥用药物和其他学习行为的行为影响的特定神经元中的分子神经适应。

关键词： 可卡因致敏，伏隔核，神经元集合，荧光激活细胞分选

引言

目前关于可卡因成瘾的神经生物学研究的一个主要假设是，慢性可卡因暴露导致纹状体和中脑边缘多巴胺奖励回路的其他成分中的长期神经适应，导致强制性药物使用和长期复发易损性（Nestler，2001; Shaham和Hope，2005; Kalivas，2009; Bowers等，2010; Wolf和Ferrario，2010）。 然而，该假设基于许多研究，这些研究仅限于测量脑区域匀浆中或在行为期间独立于其活化状态选择的神经元中的神经适应。

活化神经元与非活化神经元中神经适应的区别很重要，因为它们可能在可卡因的生理，行为和心理影响中发挥不同的作用。 对神经活动标记Fos的大量研究表明，可卡因仅激活纹状体中一小部分稀疏分布的神经元。 在特定背景特异性运动致敏后，我们已经证明只有当大鼠在药物配对环境中注射而不是在非配对环境中时才会诱导Fos（Mattson等，2008; Koya等，2009）。 最重要的是，我们已经证明这些选择性激活的神经元在可卡因和药物配对环境之间的学习关联中发挥了因果作用，这种环境介导了特定情境的致敏（Koya等，2009）。 因此，选择性激活的纹状体神经元内的神经适应可能在上下文特异性致敏和其他药物诱导的行为中的学习中发挥独特和重要的作用。

到目前为止，技术限制使得难以评估在行为期间选择性激活的少量稀疏分布的神经元内的分子改变。 激光捕获显微切割等技术（Kwon和Houpt，2010）和双标免疫组化（Berretta等，1992; Gerfen等，1995; Peters等人，1996）能够在活化的神经元内选择性地鉴定分子改变，但这些技术具有非常低的通量或不是定量的。 荧光激活细胞分选（FACS）可以成为纯化成人神经元群体进行分子分析的有效工具（Liberles和Buck，2006; Lobo等，2006）。 然而，FACS尚未用于基于其活化状态纯化神经元。 在目前的研究中，我们使用FACS来纯化来自转基因的散布的可卡因激活的纹状体神经元 首席财务官-的lacZ 大鼠并将它们独特的基因表达模式与未激活的大多数神经元中的模式进行比较。

方法

动物

女性 首席财务官-的lacZ 转基因大鼠（Kasof等，1995; Koya等，2009将雌性Sprague-Dawley大鼠（Charles River，Raleigh，NC，USA）分别圈养在温度和湿度受控的室内的标准塑料笼中。 它们保持在12：12 h反向光：黑暗循环（在20.00 h点亮），并允许自由获取食物和水。 在药物治疗前至少7天，它们适应这些住房条件。 实验程序由NIDA动物护理和使用委员会批准。

药物治疗

对于急性可卡因实验，给大鼠注射可卡因（30 mg / kg，ip; n = 8）或盐水（1 ml / kg; n = 6）并置于圆形有机玻璃室（38 cm直径）中。 注射后大鼠处死90数分钟以获得脑组织。 在不同的日子重复该处理三次以获得三个生物学重复用于微阵列分析。 另外，类似地产生三个独立的生物学重复用于定量PCR（qPCR）。 用于qPCR分析 arc，pdyn，adora2a，仅使用这三个独立的生物学重复。 用于qPCR分析 fosB，nr4a3，kcnc1和map2k6，我们还使用了来自每个微阵列样品的剩余RNA。

对于重复的可卡因实验，雌性大鼠每隔一天施用一次可卡因（15 mg / kg ip）注射致敏。 在注射天，将每只大鼠置于43×43 cm方形Plexiglas运动活动室（Med Associates，St Albans，VT，USA）中以适应30分钟。 向大鼠注射可卡因并记录运动活动，作为60分钟的行进距离。 在第四次重复注射可卡因后，大鼠在7-8天内留在其笼中。 在测试当天，使大鼠在运动活动室中习惯30 min，然后注射可卡因（30 mg / kg ip）或盐水载体。 将大鼠断头并在注射后90分钟提取脑。 在不同的周内将整个致敏处理重复三次，以获得每组的三个生物学重复，用于qPCR分析。

细胞解离

解离纹状体组织以获得单细胞悬浮液。 将大鼠断头并在两分钟内提取它们的纹状体。 将每个纹状体用剃刀刀片在冰冷的玻璃板上切碎，并置于1 ml的Hibernate A（Cat＃HALF; Brain Bits，Springfield，IL）中。 将纹状体在1ml每种纹状体的Accutase（Cat #SCR005; Chemicon，Billerica，MA）中酶促消化，在30℃下进行4 min的端对端混合。 将组织以425×g离心2分钟，并重悬于300μl冰冷的冬眠A中。所有随后的离心步骤均在4℃下进行。

通过研磨机械解离消化的纹状体组织。 将四个纹状体合并成一个Eppendorf管，并用大直径巴斯德吸管（~1.3mm）研磨十次。 将管简单地置于冰上以使大的组织块沉降; 将含有解离细胞的600μl混浊悬浮液转移到冰上的15 ml Falcon管中。 将600μL新鲜Hibernate A加入到原始Eppendorf管中，然后如上所述用中等和小直径移液管（~0.8mm和~0.4mm）重复研磨步骤。 将含有解离细胞的每种混浊悬浮液与先前的悬浮液合并。

通过预润湿的100μm和40μm细胞过滤器（Falcon brand，BD Biosciences，San Jose，CA）过滤除去合并的细胞悬浮液中的剩余细胞簇。 通过在3×g下通过三步密度梯度的Percoll（Cat＃P430; Sigma，St.Louis，MO）离心滤液1644 min来降低悬浮液中的小细胞碎片。 弃去含有碎片的混浊顶层（约2 ml）。 将剩余层中的细胞重悬于剩余的Percoll溶液中，并在550xg下离心5分钟。 将沉淀重悬于1 ml Hibernate A.

免疫标记和FACS

通过加入等体积的乙醇使50％乙醇的最终浓度固定并透化解离的细胞，并在冰上保持15分钟，偶尔混合。 将细胞在425xg下离心2分钟，并重悬于无RNase的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。 将细胞与针对NeuN的生物素化的一抗（1：1000稀释，Cat＃MAB377B，Chemicon）和针对β-半乳糖苷酶的一抗（（β-gal; 1：10000稀释，Cat＃4600-1409，Biogenesis，Poole）一起孵育。在30℃下将细胞在第一抗体中翻转旋转4分钟并在425xg下离心3分钟。用800μlPBS洗涤细胞并重悬于700μlPBS中。用荧光标记的链霉抗生物素蛋白（链霉抗生物素蛋白 - 藻红蛋白，1：1000稀释液，Cat＃SA1004-1，Invitrogen，Carlsbad，CA）和二抗（Alexa Fluor 488标记的抗山羊IgG，1：1000稀释液，Cat＃A-） 11055，Invitrogen）和15 min旋转终止。用800μlPBS洗涤细胞，以425×g离心3分钟，并重悬于1 ml PBS中。

在Johns Hopkins Bayview Campus流式细胞仪核心设施中扫描并分选免疫标记的细胞。 FACS Aria（BD，Franklin Lakes，NJ）用于细胞分选。 首先分析对照样品以确定分选测试样品的最佳标准。 具体地，使用没有抗体处理的固定细胞来设置光散射门。 然后使用用荧光二抗处理但没有一抗的固定细胞来设定内源组织荧光和链霉抗生物素蛋白或二抗的非特异性结合的阈值。 接下来，使用针对每种蛋白质（NeuN或β-gal）用一抗和二抗单标记的对照样品来补偿相邻通道中的荧光重叠。 最后，分析和分类用两种荧光标记物标记的测试样品。 将分选的细胞收集到低结合管（Cat＃022431081，Eppendorf，Westbury，NY）中，每管中加入100μlPBS。

RNA提取

分选后，将含有来自可卡因注射大鼠的βgal阳性或βgal阴性细胞或来自注射盐水的大鼠的所有NeuN阳性细胞的样品以8×g在2650℃下离心18 min。 将来自注射盐水的大鼠的NeuN阴性细胞以8×离心6000 ming 在18°C。 对于微阵列实验，根据制造商的说明用Trizol试剂（Cat＃15596-026，Invitrogen）提取RNA。 使用Bioanalyzer Picochip（Cat＃5067-1513，Agilent Technologies，Palo Alto，CA）评估RNA的质量和数量。 对于qPCR实验，根据制造商的说明用DNA酶处理，用RNEasy Micro试剂盒（Cat＃74004; Qiagen，Valencia，CA）提取RNA。 使用Nanodrop分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，DE）评估RNA的量和纯度。

微阵列实验

微阵列用于分析来自注射盐水的大鼠的NeuN阳性和NeuN阴性细胞的RNA，以及来自注射可卡因的大鼠的βgal阳性和βgal阴性神经元。 如上文在药物处理部分中所述，微阵列对于四种样品类型中的每一种包含三个生物学重复。 使用Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒（Cat＃IL1791; Ambion，Austin，TX）在cDNA合成的两步过程中标记来自每个样品的5μl总RNA，然后进行 细胞/组织 用生物素-16-UTP进行RNA转录。 将0.75μg生物素标记的cRNA与16小时杂交至Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips（Cat＃BD-27-303; Illumina，San Diego，CA）。 用Cy3标记的链霉抗生物素蛋白检测与芯片杂交的生物素化的cRNA，并使用Illumina的BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems扫描仪定量。 所有标记和分析均在Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Core进行。

实时定量PCR

实时定量PCR用于验证FACS和微阵列结果。 使用RETROscript试剂盒（Cat＃AM1710，Ambion）用寡（dT）引物将RNA逆转录成cDNA。 每个25μlPCR反应包括12.5μl的Taqman基因表达主混合物（Cat #4369514; Applied Biosystems，Foster City，CA），1.1μl各自的20μM正向和反向引物，0.25μl的100μMFAM标记的探针，5 μl水和5μl1ng /μlcDNA。 引物和探针组合[表1]使用罗氏通用探针库分析设计中心设计内含子。 使用Opticon Light Cycler（Biorad，Hercules，MD）监测PCR反应。 该程序开始于20板读取50°C进行光漂白，然后5 min在95°C，然后40循环20秒在94°C，1 min在60°C，并读板。

表1 

用于qPCR的引物和探针

首先对每个基因进行标准曲线反应以确定扩增效率[表1]。 使用效率ΔΔC计算每个扩增基因的表达水平q 其中ΔCq = C.q（实验基因） - C.q（参考基因）用于每个生物学重复。 Gorasp2 被选择作为参考基因，因为在微阵列分析中它在神经元和神经胶质之间没有不同的表达。 当加载相同量的模板时，由于在所有样品中相等的qPCR扩增，它进一步被验证为参考基因。 技术分析一式三份q 在计算ΔC之前平均值q 对于样品中的每个基因。 对于在qPCR中测量的每种mRNA，基因表达值在生物学重复中平均。 然后，为了反映倍数变化值，我们将该平均值除以来自注射盐水的大鼠的NeuN阳性细胞的平均基因表达值。 这些值在图形和表格中表示为平均值和标准误差。

免疫组化

在上述用于微阵列和qPCR实验的相同急性和重复可卡因处理后，从野生型雌性Spraque-Dawley大鼠获得脑组织。 然而，在测试一天注射后90分钟，用异氟烷深度麻醉大鼠并用100ml PBS灌注，然后用400ml 4％多聚甲醛（PFA）灌注。 将脑在PFA中后固定2小时，并在30℃下转移至4％蔗糖溶液中2-3天。 将脑在粉末状干冰上冷冻并保持在-80℃直至切片。 在Bregma 40和-2.5之间切割0.5μm厚的冠状切片（Paxinos和Watson，1998).

对Fos和Arc进行免疫标记。 简而言之，将切片在Tris缓冲盐水（TBS）中洗涤三次，并在XBS中用30％Triton X-0.2透化100 min。 将切片在TBS中再次洗涤，并在0.3℃下在振荡器上在100％Triton X-24中用PBS稀释的一抗中孵育4小时。 我们使用针对c-Fos抗体的兔多克隆抗体（1：500稀释液，Cat＃sc-52，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）和小鼠单克隆Arc抗体（1：100稀释液，Cat＃sc-17839，Santa克鲁兹生物技术）。 将切片在TBS中洗涤三次，并在室温下在摇床上在PBS中稀释的第二抗体中孵育1.5小时。 我们使用Alexa Fluor 488标记的驴抗兔抗体（1：200稀释液，Cat＃ A21206，Invitrogen）和Alexa Fluor 568标记的山羊抗小鼠抗体（1：200稀释液，Cat＃ A11004，Invitrogen）。 将切片在TBS中洗涤，安装在涂有铬矾的载玻片上，并用VectaShield硬固定的封固剂盖上盖玻片。

使用连接到Zeiss Axioskop 2.0显微镜的CCD照相机（Coolsnap Photometrics，Roper Scientific Inc.，Trenton，NJ）捕获尾状壳核和NAc中的Fos和Arc免疫反应性的荧光图像（前囟前大约2 mm）。 用于计数标记细胞的图像是在200x放大倍数下拍摄的; 用于确定Fos和Arc共定位的图像是在400x放大率下拍摄的。 使用用于Macintosh的IPLab软件，版本3.9.4 r5（Scanalytics，Inc.，Fairfax，VA）自动计数每只大鼠来自四个半球的标记细胞。 将来自所有四个半球的计数平均以获得每只大鼠的单个值。

数据分析

使用单向方差分析（ANOVA）对运动敏化数据进行分析，并重复测量4天内注射时间的主要影响。 统计学显着性设定为p <0.05。 如先前所述，使用DIANE 6.0（基于电子表格的基于SAS JMP 7.0的微阵列分析程序）分析微阵列数据。Garg等，2009）。 来自微阵列的荧光强度数据通过检测进行过滤 p价值和 Z 正常化。 使用散点图，主成分分析和基因样品分析样品质量 Z基于得分的分层聚类，以排除可能的异常值。 然后使用ANOVA测试消除每个比较组内变异较大的基因。 如果p <0.01，绝对，则基因被鉴定为差异表达 Z-比率≥1.5，且错误发现率（fdr）<0.07。 对于qPCR数据，单向ANOVA用于比较每个基因的数据。 统计学显着性设定为p <0.05。 对于Fos和Arc免疫组织化学，假设差异不相等的t检验用于计算统计学显着性，设置为p <0.05。

成果

cfos-lacZ转基因大鼠

首席财务官-的lacZ 这些大鼠的转基因受a调节 的c-fos 启动子类似于内源启动子 的c-fos 基因并因此在神经元中被高水平的兴奋性突触输入激活（Shin等人，1990; Labiner等，1993; Sgambato等人，1997）。 蛋白质的产物 首席财务官-的lacZ 转基因β-半乳糖苷酶（βgal）与强活化神经元中的c-Fos共表达（Koya等，2009并且用于在随后的FACS纯化程序中标记活化的纹状体神经元。

单次急性可卡因注射后FACS纯化活化的纹状体神经元

整个striata来自 首席财务官-的lacZ 在家笼外急性注射90 mg / kg可卡因或盐水后，大鼠30分钟。 在随后的微阵列和定量PCR（qPCR）分析中，在FACS纯化之前合并来自相似处理的大鼠的解离的纹状体细胞用于每个生物学重复。 最初根据它们的前向和侧向光散射特征分析解离的纹状体细胞[图1a]。 大多数NeuN标记的神经元是在沿着图的下部的一系列事件中发现的。 因此，所有后续分析都是前向门控，仅包括在该条带内发现的事件。

图1 

单次注射可卡因治疗大鼠βgal标记神经元的荧光激活细胞分选

根据它们与神经元标记物NeuN和神经活化标记物βgal的免疫标记程度分离该门内的细胞。 在从注射可卡因的大鼠获得的组织中，大约15％的NeuN标记的神经元具有高水平的βgal[图1b]，对应于每只大鼠大约100,000βgal标记的神经元。 所有βgal标记的细胞共表达NeuN，表明只有神经元表达βgal。 相反，从注射盐水的大鼠获得的极少数NeuN标记的神经元表达活化标记物βgal或Fos，其支持βgal和Fos免疫反应性作为注射可卡因的大鼠中神经活化的标志物。 来自注射盐水的大鼠的低数量的表达βgal的神经元没有提供足够的细胞用于随后的分子分析。 因此，在从注射盐水的大鼠获得的纹状体组织的所有后续实验中，我们仅使用NeuN标记来分离神经元和非神经元细胞。 总体而言，所有纹状体细胞体的约30％是NeuN阳性，其对应于每只大鼠约600,000纹状体神经元。 当用荧光显微镜检查FACS纯化的细胞时，所有细胞都是圆形的并且没有过程[图2]。 显微镜观察证实，FACS分选的细胞已适当标记NeuN-和βgal免疫反应性。 用第二轮流式细胞仪评估时，发现FACS纯化的细胞样品纯度> 90％（数据未显示）。

图2 

FACS纯化细胞和碎片的显微镜照片

我们用微阵列测定了我们的FACS纯化程序的选择性，以分析FACS纯化细胞的基因表达模式。 我们比较了注射可卡因的大鼠的βgal阳性和βgal阴性神经元中的基因表达以及来自注射盐水的大鼠的NeuN阳性和NeuN阴性细胞。 主成分和聚类分析表明，主要的分化因素是细胞是神经元还是神经胶质[图3a]。 第二个区分因素是用于将激活的神经元与未激活的神经元分开的βgal表达。 如果p <0.01，绝对，则基因被鉴定为差异表达 Z-比率≥1.5，且错误发现率（fdr）<0.07。 我们发现，与从可卡因注射的大鼠的相同纹状体组织获得的βgal阴性神经元相比，βgal阳性神经元增加了125个基因，减少了467个基因[图3b]。 当将可卡因注射大鼠的相同βgal阳性神经元与盐水注射大鼠所有NeuN标记神经元的对照样品进行比较时，βgal阳性神经元中有133个基因增加而890个基因减少。 值得注意的是，两个对照组（注射可卡因的大鼠的βgal阴性神经元和注射盐水的大鼠的所有NeuN标记的神经元）产生了非常相似的基因表达模式。 这些对照组之间的基因表达没有显着差异[图3b].

图3 

单次注射可卡因或盐水后从大鼠纹状体分选的细胞的微阵列分析

在不同样本组中发现的特定基因证实使用FACS分离活化的非活化神经元，以及神经元与非神经元细胞的分离[表2]。 注射可卡因的大鼠的βEG阳性神经元表达相对于来自注射可卡因的大鼠的βgal阴性神经元或来自注射盐水的大鼠的所有NeuN标记的神经元的更高水平的许多神经活化标记基因[图3c]。 包括这些活性标记基因 的c-fos, JUNB, 弧, EGR 家庭（1，2，4）和 nr4a3 (Guzowski等，2005）。 有趣的是，这些βgal阳性神经元也表达了显着更高水平的D1多巴胺受体细胞类型特异性标记物prodynorphin基因和显着更低水平的D2多巴胺受体基因。

表2 

来自急性可卡因实验的微阵列和qPCR数据的总结。

使用qPCR验证微阵列基因表达数据。 活动标记基因 FOSB, 弧及 nr4a3 相对于注射可卡因的大鼠的βgal阴性神经元和来自注射盐水的大鼠的所有神经元，来自可卡因注射大鼠的βgal阳性神经元中的表达水平更高[表达]图4a; 数据和统计信息 表2]。 βgal阳性神经元也表达更高水平的prodynorphin基因[图4b]。 虽然βgal阳性神经元的表达水平明显低于几个基因，包括A2A腺苷受体，Kv3.1钾通道和map2k6 / MEKK6基因，但只有Kv3.1和map2k6 / MEKK6表达水平在统计学上有所不同[qPCR] [图4c]。 总之，用qPCR评估的基因表达改变几乎与通过微阵列实验评估的基因表达改变相同。

图4 

与来自相同大鼠的βgal阴性神经元或注射盐水的大鼠的所有神经元相比，定量PCR显示急性可卡因注射后βgal阳性神经元的不同基因表达谱。

为了确定激活的神经元中的mRNA变化是否反映在蛋白质水平，我们使用来自可卡因和盐水注射的野生型雌性大鼠的冠状脑切片的免疫组织化学分析[图5]。 这些切片未经历解离或FACS，因此免疫组织化学分析不受FACS程序中发现的细胞解离的影响。 来自可卡因注射大鼠的腹侧纹状体[图5a]，神经活动标志物Fos和Arc在同一细胞中共表达：所有Fos阳性细胞的85±4％均为Arc阳性，而所有Arc阳性细胞的82±3％均为Fos阳性。 可卡因注射在Fos标记的神经元中产生2.7倍增加，在Arc标记的神经元中产生2.7倍增加。 来自可卡因注射大鼠的背侧纹状体[图5b]，所有Fos阳性细胞的80±2％均为Arc阳性，而所有Arc阳性细胞的86±3％均为Fos阳性。 可卡因注射在Fos标记的神经元中产生4.4倍增加，在Arc标记的神经元中产生3.8倍增加。

图5 

单次注射可卡因后，Fos和Arc在（a）腹侧纹状体和（b）背侧纹状体中共表达

从可卡因致敏大鼠的FACS纯化活化的纹状体神经元

在第二次FACS实验中，所有大鼠都用重复的可卡因注射致敏。 在运动箱中重复使用可卡因可增强可卡因诱导的运动：第7天的运动是180运动的18±1％（4重复注射时间的主要影响，F3，363 = 24.9，p <0.001），表明明显的精神运动敏化。 在测试日的七天后，在同一运动箱中向大鼠施用可卡因或盐水。 XNUMX分钟后，提取包含NAc的纹状体组织，并使用上述程序将细胞FACS纯化。

根据它们与神经元标记物NeuN和神经活化标记物βgal的免疫标记程度，分离与先前实验中相同的光散射门控事件条带内的细胞。 在从注射可卡因的大鼠获得的组织中，大约10％的NeuN标记的神经元具有高水平的βgal[图6]，对应于每只大鼠大约60,000βgal标记的神经元。 所有βgal标记的细胞共表达NeuN，表明只有神经元表达βgal。 再次，在测试当天从注射盐水的大鼠获得的组织产生非常少的表达βgal或Fos的神经元，因此没有足够的细胞用于随后的分子分析。 因此，我们仅使用NeuN标记来分离从注射盐水的大鼠获得的神经元和非神经元细胞。 注射盐水的大鼠中所有细胞体的大约30％是NeuN阳性，其在该实验中对应于每只大鼠约400,000纹状体神经元。

图6 

重复可卡因治疗后用可卡因7攻击的致敏大鼠的βgal标记神经元的荧光激活细胞分选

我们使用qPCR比较可卡因致敏后可卡因注射大鼠的βgal阳性和βgal阴性神经元以及注射盐水的大鼠所有NeuN阳性神经元的基因表达。 可卡因注射大鼠的βgal阳性神经元表达较高水平的三种神经活动标记基因 FOSB, 弧及 nr4a3–相对于相同可卡因注射大鼠的βgal阴性神经元，以及相对于盐水注射大鼠的所有神经元[图7a; 数据和统计信息 表3]。 βgal阳性神经元也表达更高水平的prodynorphin基因，类似于单次可卡因注射实验[图7b]。 相反，βgal阳性神经元的几种基因表达水平较低[图7c]， 包含 Drd2 编码D2多巴胺受体，和 Map2k6 编码激活p38 MAPK的激酶，类似于单次急性可卡因注射实验。 最后，βgal阳性神经元的表达增加 dusp1，也称为mkp1 [图7c]，编码使p38 MAPK失活的磷酸酶（Sgambato等人，1998).

图7 

定量PCR显示来自致敏可卡因攻击大鼠的βgal阳性神经元中的不同基因表达谱，与来自相同大鼠的βgal阴性神经元或来自盐水攻击大鼠的所有神经元相比。
表3 

来自重复可卡因实验的qPCR数据的总结。

为了确定活化的神经元中的mRNA改变是否反映在蛋白质水平，我们使用来自野生型可卡因致敏的雌性大鼠的冠状脑切片的免疫组织化学分析，在测试当天注射可卡因或盐水。 在注射可卡因的大鼠腹侧纹状体中，神经活动标志物Fos和Arc在同一细胞中共表达：所有Fos阳性细胞的90±2％均为Arc阳性，所有Arc阳性的83±2％细胞是Fos阳性的。 可卡因测试注射产生Fos标记神经元的2.3倍增加和Arc标记神经元的2.2倍增加。 在来自可卡因注射大鼠的背侧纹状体中，所有Fos阳性细胞的93±2％是弧阳性，并且所有Arc阳性细胞的90±3％是Fos阳性。 可卡因测试注射产生Fos标记神经元的4.4倍增加和Arc标记神经元的4.5倍增加。 因此，很少有非Fos标记的细胞表达Arc，很少有非Arc标记的细胞表达Fos，这支持了我们从分选的细胞中发现的结果。

讨论

我们开发了一种纯化和评估神经元内分子改变的方法，该方法仅由其在可卡因诱导的运动活动期间的先前活化状态定义。 来自微阵列，qPCR和免疫组织化学实验的数据独立地证实，我们的FACS程序鉴定了活化神经元内的独特分子改变，如 的c-fos 启动子诱导βgal表达。 使用该方法的主要生物学发现是立即早期基因（IEG）仅在活化的神经元中诱导，而IEG表达在未激活的大多数神经元中未改变或甚至降低。 由于许多这些IEG神经活动标记物也是转录因子，因此可能在这些活化的神经元内诱导出非常不同的基因表达模式，这可能有助于可卡因的生理和行为影响（例如，见（见Curran和Franza，1988; Nestler等，1993; McClung等，2004; Loebrich和Nedivi，2009).

活化和非活化神经元之间的差异IEG诱导支持这样的假设：在可卡因诱导的运动过程中只有少数神经元被强烈激活，而大多数神经元被激活的程度要小得多或根本没有。 野生型大鼠的电生理学实验表明，Fos蛋白表达与高水平的兴奋性突触输入相关（Shin等人，1990; Labiner等，1993; Sgambato等人，1997）。 我们知道Fos和βgal表达在相同的神经元中受到类似的调节 首席财务官-的lacZ 老鼠（Koya等，2009）。 因此，我们推断仅在少数纹状体神经元中增加的βgal和IEG表达表明只有少数纹状体神经元响应可卡因施用而接受高水平的兴奋性突触输入。

纹状体神经元的离散激活与描述多巴胺对纹状体神经元活动的相反作用的基础状态 - 状态假设是一致的。 可卡因诱导的多巴胺被认为通过增强已经处于高活动状态的神经元的持续电生理活动来增强高活性和低活性神经元之间的差异，同时减弱大多数具有较低活性的神经元的持续活动（Wilson和Kawaguchi，1996; Hernandez-Lopez等，1997; Nicola等人，2000; O'Donnell，2003; Nicola等人，2004）。 由此产生的信噪比的增加不仅增强了急性信号传导期间的选择性，而且如我们的研究所示，也可能仅在高活性神经元中诱导独特的分子神经适应。 同时，由注射可卡因的大鼠组成大多数纹状体神经元的βgal阴性神经元中的基因表达似乎与注射盐水的大鼠的纹状体神经元中的基因表达没有差异; 这支持了大多数纹状体神经元在可卡因暴露期间保留在下游的假设。

p38 MAP激酶信号传导途径的组分也在活化和未活化的神经元之间差异性改变。 激活p2的激酶Map6k6 / MEKK38的基因表达降低，而Mkp1 / Dusp1的基因表达，磷酸酶使p38失活（Sgambato等人，1998），在激活的神经元中增加，但在非激活的神经元中没有增加。 因此，整体p38 MAPK信号，显示在突触可塑性中发挥作用（Bolshakov等人，2000; Izumi等，2008相对于未激活的大多数神经元，可以在激活的神经元中减弱。

FACS还可以帮助识别急性或重复可卡因暴露后激活的神经元类型。 我们发现D1神经元标记基因prodynorphin在激活的神经元中表达更高，D2神经元标记基因D2多巴胺受体和A2A腺苷受体在激活的神经元中表达更低。 这表明Fos主要在D1纹状体神经元中被诱导。 虽然这与许多免疫组织化学研究一致，这些研究报告了在精神兴奋剂注射后主要在D1神经元中的Fos诱导。 家笼 (Berretta等，1992; Cenci等，1992），它与相对于相对精神兴奋剂注射后发现的D1和D2神经元的平等激活相矛盾。 新奇的环境 在老鼠的笼子外面（Jaber等，1995; Badiani等人，1999; Hope等人，2006).

因为我们在FACS期间使用相同的βgal标记来识别活化的神经元，就像我们之前描述的Daun02灭活程序一样（Koya等，2009），我们正在观察神经元集合中的​​独特分子变化是合理的，这些变异对于可卡因诱导的运动的特定情境敏感性的学习成分是必需的。 我们以前发现，假定集合中仅少量稀疏分布的神经元的灭活足以破坏特定情境的可卡因精神运动致敏（Koya等，2009）。 使用相同的女性复制了这一发现 首席财务官-的lacZ 本研究中使用的大鼠和致敏方案[http://irp.drugabuse.gov]。 这些神经元对所有刺激本身并不敏感，因为改变环境或施用药物的环境激活了可卡因注射后的一组不同的纹状体神经元（Mattson等，2008; Koya等，2009）。 特定纹状体神经元集合的选择似乎主要取决于皮质和皮层下谷氨酸能传入的活动模式（Pennartz等，1994; O'Donnell，2003这些输入本身由行为期间存在的特定环境和内部感受刺激决定。 根据此前的工作以及我们目前的数据，我们假设在我们的致敏方案中重复配对可卡因与环境刺激在反复激活的神经元集合内产生独特的分子改变，这可能有助于学习特定情境敏感的学习关联。

总之，我们展示了FACS的新应用，以分离在急性可卡因诱导的运动活动期间选择性激活的成体神经元和重复的可卡因诱导的运动致敏。 我们建议这种方法也可用于识别神经元集合中独特的分子神经适应，编码滥用药物和其他学习行为的行为效应。 这些独特的分子神经适应在神经可塑性和行为中的因果作用最终必须通过仅在激活的神经元中操纵基因表达来检验; 然而，这项技术尚未开发。

致谢

该研究得到了国家药物滥用研究所的校内研究计划的支持。 D. Guez-Barber得到NIH MSTP TG 5T32GM07205，国家药物滥用研究所的F30DA024931奖和耶鲁大学精神病学Charles BG Murphy教席的支持。 我们感谢Joe Chrest对FACS的出色技术帮助，感谢Chris Cheadle，Tonya Watkins和Alan Berger在微阵列方面所做的工作。 我们感谢Yavin Shaham对手稿的有益评论。

脚注

 

本手稿的任何作者均不存在任何利益冲突。

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