Cdk5使多巴胺D2受体磷酸化并减弱下游信号传导（2013）

评论：似乎表明Cdk5导致多巴胺D2受体的下调。 令人惊讶的是，翻译因子deltafosb诱导Cdk5的产生。

Jeong J，Park Yu，Kim DK，Lee S，Kwak Y，et al。 （2013）PLoS ONE 8（12）：e84482。 DOI：10.1371 / journal.pone.0084482

抽象

多巴胺D2受体（DRD2）是一种关键受体，可介导多巴胺相关的大脑功能，如情绪，奖赏和情绪。 细胞周期蛋白依赖性激酶5（Cdk5）是一种脯氨酸定向的丝氨酸/苏氨酸激酶，其功能与脑回馈电路有关。 在本研究中，我们发现DRD321（D321i2）的第三个细胞内环中的丝氨酸2残基（S3）是Cdk5的新型调节位点。 在D5i321中观察到Cdk2依赖性的S3磷酸化 细胞/组织 和细胞培养系统。

我们进一步观察到S321的磷酸化损害了DRD2的激动剂刺激的表面表达并且降低了与DRD2的G蛋白偶联。 此外，下游cAMP途径在异源系统和来自p35敲除胚胎的原代神经元培养物中受到影响，这可能是由于DRD2的抑制活性降低。 这些结果表明Cdk5介导的S321磷酸化抑制DRD2功能，为多巴胺信号传导提供了新的调节机制。

图

引文： Jeong J，Park Yu，Kim DK，Lee S，Kwak Y，et al。 （2013）Cdk5使多巴胺D2受体磷酸化并减弱下游信号。 PLoS ONE 8（12）：e84482。 DOI：10.1371 / journal.pone.0084482

责任编辑： James Porter，美利坚合众国北达科他大学

收稿日期： 可能是20，2013; 公认： 十一月14，2013; 出版日期： 2013 年 12 月 31 日

版权： ©2013 Jeong等。 这是一份根据条款分发的开放获取文章 知识共享署名许可，如果原始作者和来源被记入贷方，则允许在任何媒体中不受限制地使用，分发和复制。

资金： 这项工作得到了韩国政府（MSIP）的资助（NRF-2012R1A2A2A01012923和NRF-2012R1A4A1028200）的支持，并得到了韩国NRF（2012K2A1A2033117）和韩国脑研究所（KBRI）管理的国际合作项目框架的支持。 MSIP基础研究计划（2031-415）。 SKP是2004和2006全国精神分裂症和抑郁症研究联盟（NARSAD）青年研究员奖的获得者。 资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

利益争夺： 作者宣称没有竞争利益存在。

介绍

多巴胺信号传导涉及各种脑功能，包括运动协调，情绪控制和奖励机制 [1]. 脊椎动物中多巴胺信号传导的主要成分是由纹状体中型多刺神经元（MSNs）发挥作用，该神经元选择性地表达多巴胺受体的子集并主要从腹侧被盖区（VTA）和黑质（SN）接收多巴胺能输入。) [2]。 多巴胺受体是G蛋白偶联受体（GPCR），具有七个跨膜结构域，由两个亚型组成， D1样和D2样受体，介导多巴胺信号传导中的相互作用 [1]. 例如，多巴胺D1样受体（D1，D5）通过G激活腺苷酸环化酶αS 并且增加细胞内cAMP水平，但多巴胺D2样受体（D2，D3，D4）通过G抑制腺苷酸环化酶α我 并降低细胞内cAMP水平 [1], [3].

在多巴胺受体中，D2受体（DRD2）涉及多种主要精神疾病的病理生理学，包括精神分裂症和药物成瘾 [4]这样许多抗精神病药物至少部分靶向DRD2。 还已知DRD2活性与动物模型中滥用药物的行为后果很好地相关 [5]。 抗抑郁药和情绪稳定剂的功效也与DRA2细胞表面表达的改变或PKA，ERK和GSK3介导的下游细胞内信号传导有关。 [1], [4], [6]。 尽管DRD2在大脑中具有这些关键作用，但赋予DRD2属性异质性和复杂性的详细调控机制尚未完全了解。

汇总的证据表明，DRD2活动的微调涉及多个翻译后修改。 在早期光亲和标记研究中揭示了DRD2的广泛糖基化 [7]并且DRD2内的二硫键形成也被鉴定为配体结合的重要修饰 [8]。 此外，DRD2的磷酸化位点最初由 细胞/组织 用放射性同位素测定，为各种激酶介导的各种调节途径提供途径 [9]。 实际上，蛋白激酶C（PKC）调节DRD2介导的细胞内钙动员，并调节DRD2与细胞骨架蛋白的相互作用。 [10]。 GPCR激酶磷酸化2（GRK2）调节DRD2的激动剂诱导的再敏化模式 [11].

细胞周期蛋白依赖性激酶5（Cdk5）是一种脯氨酸定向的丝氨酸/苏氨酸激酶，由于其特异性激活剂的脑特异性表达而具有优先活性， p35和p39 [12]。 Cdk5参与各种神经元过程，包括神经元迁移和轴突导向，Cdk5和p35 null小鼠显示皮质分层缺陷 [13]。 最近，显示Cdk1对WAVE5和ephexin的磷酸化调节树突棘的形态发生。 [14]。 此外，Cdk5还调节NMDA受体，NR2B和NR2A介导的NMDA电流的表面表达水平。 [15], [16]。 值得注意的是，多项证据表明Cdk5与多巴胺系统之间存在密切关系。 Cdk5磷酸化酪氨酸羟化酶（TH），调节其稳定性，从而维持多巴胺能稳态 [17]。 在突触后神经元中，当多巴胺的T75残基和环磷酸化调节的磷蛋白-32kD（DARPP-32）被Cdk5磷酸化时，它可以抑制PKA活性，从而拮抗多巴胺DRD1介导的PKA信号传导。 [18]. 有趣的是，当大鼠长期服用多巴胺受体的间接激动剂可卡因时，中等多刺神经元中Cdk5的mRNA和蛋白水平增加 [19]. 总之，Cdk5似乎参与药物诱导的突触适应。 在本研究中，我们展示了DRD2和Cdk5的功能性相互作用，进一步扩展了Cdk5在多巴胺信号传导中的作用。

材料和方法

抗体

针对含有DRD321的第三细胞内环（D321i2）的磷酸丝氨酸2（pS3）的肽产生抗兔血清。 磷酸肽CNPDpSPAKPEK（PEPTRON）用于制备用于亲和纯化的肽缀合柱（20401，PIERCE）。 按照制造商的说明，通过亲和纯化系统富集抗pS321抗体。 将纯化的磷酸抗体储存在含有0.1％叠氮化钠和0.1％明胶的PBS中。 抗小鼠抗Cdk5抗体（sc-249）和抗兔抗p35抗体（sc-820）用于Cdk5 / p35的Western印迹和免疫细胞化学。 抗小鼠抗GFP抗体（sc-9996）用于DRD2-GFP的免疫沉淀和Western印迹。 抗兔抗FLAG抗体（sc-807），抗兔抗HA抗体（sc-805），抗小鼠抗GST抗体（sc-138）和抗小鼠抗GAPDH抗体（sc- 32293）购自Santa Cruz Biotechnologies。

动物

p35敲除小鼠是来自日本RIKEN脑科学研究所的Katsuhiko Mikoshiba博士的礼物，用于原代神经元培养。 用于基因分型的引物组是如前所述的5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG，5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC和5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT。 [20]。 将ICR小鼠和Sprague Dawley大鼠用于脑裂解物制备。 所有动物程序均经浦项科技大学动物护理和使用委员会批准。

质粒构建体

使用EGFP-N2质粒载体中的人DRD1长同种型和pFLAG-CMV-2质粒载体中的DRD212的第三细胞内环（373-29氨基酸残基，包括DRD2长同种型特有的2另外的氨基酸残基）。 将人Cdk5插入pCMV-HA质粒载体中，并将​​人p35插入pcDNA 3.1质粒载体中。 将人Cdk5与人p35一起插入pcDNA 3.1载体中的巨细胞病毒（CMV）启动子下，制备双重表达构建体（Cdk5 / p35），用于免疫细胞化学，受体内化测定，[35S] -GTPγS结合测定，放射性配体结合测定和cAMP酶免疫测定。

体外 激酶测定

IP连接 细胞/组织 激酶测定如下进行。 通过Dounce匀浆器的3冲程在50 mL红细胞裂解缓冲液（ELB）（8.0 mM Tris（pH 250），5 mM NaCl，0.1 mM EDTA，40％NP-20）中裂解一个完整的小鼠脑，以获得均质化的脑裂解物。 。 将裂解物在冰上孵育30 min，超声处理，并在16,000×下离心 g 对于10分钟 用抗兔抗p35抗体免疫沉淀上清液，得到活性Cdk5 / p35复合物。 将Cdk5 / p35复合物和纯化的GST融合蛋白与腺苷5'-三磷酸盐混合，[γ-32P]（NEG-502H，PerkinElmer）并在激酶缓冲液（30 mM HEPES（pH 7.2），10 mM MgCl中孵育）2，0.2 mM DTT）用于室温下的1 h [18], [21]。 纯化的Cdk5 / p25复合物（14-516，Millipore）也用于 细胞/组织 如上所述的激酶测定。 将2×样品上样缓冲液加入到反应混合物中并在100℃下煮沸。 然后将样品进行SDS-PAGE并通过放射自显影评估干燥的凝胶。

液相色谱（LC） - 质谱（MS）/ MS分析

在IP连接后通过LC-MS / MS分析重组GST-D2i3蛋白 细胞/组织 激酶试验。 我们使用X !! Tandem（版本Dec-01-2008）进行LC-MS / MS数据的肽鉴定。 每个RAW数据文件首先使用反式蛋白质组管道（TPP;版本4.3）转换为mzXML。 然后使用X !! Tandem对转化的mzXML中的MS / MS扫描进行针对UniProt小鼠蛋白质序列数据库（释放2010_07）的搜索，包括GST-D2i3序列。 对于前体离子，公差设定为3 Da，对于碎片离子，公差设定为2 Da。 使用胰蛋白酶的酶特异性。 可变修饰选项用于半胱氨酸的氨甲酰甲基化（57.021 Da），甲硫氨酸的氧化（15.995 Da），天冬酰胺的水解（0.987 Da）和丝氨酸的磷酸化（79.966 Da）。

免疫沉淀

在ELB裂解缓冲液中对细胞裂解物进行免疫沉淀。 将抗GFP抗体加入裂解物中并在3℃下孵育4 h。 使用蛋白-A琼脂糖纯化免疫复合物。 将沉淀物与SDS样品上样缓冲液在30℃下孵育37 min，并进行SDS-PAGE和Western印迹。

GST下拉分析

将10μg纯化的GST和GST-D2i3与大鼠脑裂解物在1.5℃下孵育4 h。 加入用裂解缓冲液平衡的30μL谷胱甘肽（GSH） - 缀合的Sepharose 4B珠（17-0756-01，GE Healthcare），并孵育另外的1 h。 通过在2,000×下离心收集珠子g 并用裂解缓冲液4冲洗一次 [22], [23]。 使用抗Cdk5和抗p35抗体通过蛋白质印迹分析沉淀物。

免疫组化

将用盖玻片培养的转染的HEK 293细胞和纹状体神经元用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，并通过浸入冷的4％多聚甲醛/ PBS中固定30 min。 将一抗在封闭溶液（2％马血清和PBS中的1％Triton X-100）中稀释。 Alexafluor-647-缀合的抗小鼠抗体（A20990，Invitrogen）和Alexafluor-568-缀合的抗兔抗体（A11011，Invitrogen）用作二抗。 Hoechst用于细胞核染色。 通过共聚焦显微镜（Olympus，FluoView-1000）获得图像。

受体内化分析

转染后的24小鼠，用1μM喹吡罗（Q102，Sigma）处理细胞30 min，90 min处于37℃。 将细胞重悬于2mL冷PBS中，并将200μL等分试样用于各反应。 药物处理在室温下进行3 h，浓度如下： 3 nM [3H] - 螺哌隆（NET-565，PerkinElmer），3μM舒必利（895，TOCRIS），10μM氟哌啶醇（H1512，Sigma）。 疏水[3H] -spiperone用于标记总表达受体，亲水性舒必利用于替代膜受体结合[3H] -spiperone信号。 通过从总表达受体值中减去细胞内受体值来计算膜相关受体信号。 在GF / B（Millipore）过滤器上过滤细胞，并用洗涤缓冲液（3 mM Tris-HCl（pH 50），7.4 mM NaCl）洗涤100次。 将滤器干燥并使用液体闪烁计数器测量残余放射性 [24].

细胞膜制备

转染后的100 mm培养皿中的汇合细胞用冰冷的PBS洗涤，并在1 mL HME缓冲液（25 mM HEPES（pH 7.5），2 mM MgCl）中收获2，1 mM EDTA）。 将均质化的裂解物用500×g离心10分钟，然后将上清液用15×g离心10分钟。 将重悬于HME缓冲液中的沉淀用于测定。

[35S] -GTPγS结合分析

将细胞膜级分与1μM喹吡罗（Q102，Sigma）在测定缓冲液（25 mM HEPES（pH 7.5），1.5 mM MgCl）中预温育。2100 min，1 mM NaCl，0.01 mM EDTA和10 mM GDP）。 [35S] -GTPγ将S（NET-030H，PerkinElmer）加入到3μL中的30 nM的终浓度，并进一步温育90 min。 170μL冰冷缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.0），100 mM NaCl，10 mM MgCl2加入0.1 mM GTP）以终止反应。 在GF / B过滤器（Millipore）上过滤膜，并用洗涤缓冲液（3 mM Tris-HCl（pH 50），7.4 mM NaCl）洗涤100次。 干燥过滤器并使用闪烁计数器测量放射性 [25], [26].

放射性配体结合试验

将制备的细胞膜与0.01 nM一起孵育[3H] -spiperone（NET-565，PerkinElmer）和测定缓冲液中102 min浓度增加的喹吡罗（Q30，Sigma）（25 mM HEPES（pH 7.5），1.5 mM MgCl）2，100 mM NaCl，1 mM EDTA）。 在GF / B过滤器（Millipore）上过滤膜，并用洗涤缓冲液（3 mM Tris-HCl（pH 50），7.4 mM NaCl）洗涤100次。 通过GF / C过滤器快速过滤终止反应。 使用液体闪烁计数器测量残余放射性 [27]–[29].

cAMP酶免疫测定

将转染的HEK 293细胞用10μM咯利普兰（R6520，Sigma）预处理1 h，然后用0.1μM毛喉素（F6886，Sigma）和递增浓度的喹吡罗（Q102，Sigma）处理30 min。 原代培养的纹状体神经元用10μM咯利普兰治疗1 h，然后用1μM多巴胺治疗1 h [22]。 用0.1 M HCl制备细胞裂解物，并按照制造商的说明通过cAMP酶免疫测定试剂盒（Sapphire Bioscience）检测cAMP水平。

原代培养的纹状体神经元

从小鼠胚胎脑（E15）分离纹状体区域。 将解剖的组织在含有11095％胰蛋白酶（T0.25-4549，Sigma）和100％DNase I的最小必需培养基（MEM）（0.1，Invitrogen）中在6℃下解离37 min。 将细胞重悬于平板培养基（具有0.01 M HEPES（pH 7.4）和10％（vol / vol）马血清（16050-122，GIBCO））的MEM中。 将神经元培养7天 细胞/组织 （DIV 7）在施用B27补充物（17504-044，Invitrogen）的MEM中，然后应用于cAMP酶免疫测定。

成果

Cdk5使DRD321的第三细胞内环中的丝氨酸2磷酸化 细胞/组织

为了鉴定新的Cdk5底物，我们使用（S / T）PX（K / H / R）作为Cdk5识别共有序列进行了系统搜索。 [30] 并将DRD2鉴定为候选底物。 共有序列，包括丝氨酸321，位于DRD2（D2i3）的第三个细胞内环中，其中涉及各种调节机制。 [3], [10], [11]。 该序列在脊椎动物的DRD2中具有进化保守性，这意味着残留物的功能重要性（图1A).

缩略图

图1。 Cdk5在DRD321的第三个细胞内环中磷酸化丝氨酸2 体外。

（A）氨基酸序列比对显示来自不同物种的DRD2的保守区域（阴影）。 潜在的Cdk5磷酸化位点用星号表示。 （B）知识产权相关 细胞/组织 用重组GST-D2i3和GST-D2i3突变蛋白进行激酶测定。 通过抗p5免疫沉淀从小鼠脑提取物富集的Cdk35 / p35复合物用于激酶反应。 显示了磷酸化蛋白质的放射自显影图以及相同凝胶的考马斯亮蓝染色。 箭头指示对应于GST-D2i3的放射性信号，空心箭头指示来自p35的放射性信号。 （C）D2i3的磷酸化肽片段的MS / MS谱。 理论碎片模式显示在谱图下方。 在所有碎片离子中，检测到的y-和b-离子在光谱中表示。 他们6 和y7 离子强烈表明丝氨酸321的磷酸化。 （d） 细胞/组织 使用GST-D5i25和GST-D2i3突变蛋白用纯化的Cdk2 / GST-p3复合物进行激酶测定。 在放射自显影照片中显示磷酸化蛋白质，以及考马斯亮蓝染色。 箭头指示对应GST-D2i3的放射性信号，空心箭头指示来自GST-p25的放射性信号。

DOI：10.1371 / journal.pone.0084482.g001

为了评估Cdk5磷酸化D2i3的能力，我们进行了IP连接 细胞/组织 通过p5免疫沉淀，使用纯化的重组GST-D35i35（氨基酸残基2-3）蛋白作为底物，使用从小鼠脑裂解物富集的活性Cdk212 / p373复合物的激酶测定。 我们观察到纯化的GST-D2i3和GST-D2i3 S297A蛋白中的磷酸化信号，但是使用GST-D2i3 S321A显着降低了信号（图1B）。 为了进一步验证GST-D321i2中丝氨酸3的磷酸化，我们对来自IP连接的样品进行了LC-MS / MS分析 细胞/组织 使用LTQ XL质谱法的激酶测定。 一致地，回收了对应于磷酸丝氨酸321肽的质量的磷酸肽（图1C）。 考虑到LC-MS / MS分析过程中数据相关的采集倾向于检测样品中丰富的蛋白质 [31]，该数据表明丝氨酸321残基是D5i2区域中Cdk3的主要磷酸化位点。 为了证明Cdk321在GST-D2i3中丝氨酸5的直接磷酸化， 细胞/组织 使用纯化的Cdk5 / GST-p25复合物与纯化的重组GST-D2i3蛋白进行激酶测定。 我们在GST-D2i3 S2A中发现GST-D3i321中存在显着的磷酸化信号（图1D）。 总之，这些结果表明D2i3 S321残基是Cdk5介导的磷酸化的优先靶标。

Cdk5在细胞中DRD321的第三个细胞内环中磷酸化丝氨酸2

为了鉴定丝氨酸321的磷酸化，我们提出了对磷酸丝氨酸321（pS321）特异的抗体。 来自IP链接的样本 细胞/组织 使用抗pS321抗体通过蛋白质印迹分析激酶测定。 印迹显示激酶反应中的明显条带依赖于GST-D2i3（图2A）。 为了验证细胞中Cdk321对DRD2中丝氨酸5的潜在磷酸化，使用抗GFP通过蛋白质印迹分析来自表达DRD293-GFP和DRD2 S2A-GFP的HEK 321细胞的抗GFP免疫沉淀物，有或没有HA-Cdk5和p35。抗pS321抗体。 仅在存在DRD2-GFP的情况下观察到抗GFP抗体的特征模糊带信号，其已知由DRD2的过度糖基化引起，并且抗pS321抗体仅用Cdk2 / p5共表达检测到类似的DRD35信号（图2B) [7]。 为了进一步验证Cdk321对丝氨酸5的磷酸化，产生D2i3（FLAG-D2i3）和突变形式的D2i3（FLAG-D2i3 S321A）。 通过SDS-凝胶迁移率变动分析分析在HEK 2细胞中用或不用HA-Cdk3和p2表达的FLAG-D3i321和FLAG-D5i35 S293A。 对于FLAG-D5i2观察到显着的Cdk3依赖性迁移率变化，但对于FLAG-D2i3 S321A观察不到（图2C）。 我们还评估了激动剂刺激后Ser2的DRD321的磷酸化水平。 通过喹吡罗刺激表达DRD293-GFP和Cdk2 / p5复合物的HEK 35细胞，并使用抗GFP和抗pS321抗体通过蛋白质印迹分析来自细胞裂解物的抗GFP免疫沉淀物。 我们发现CdX5介导的Ser2中DRD321的磷酸化不受激动剂刺激的影响，这似乎不同于GRK和PKC介导的磷酸化（图2D) [32], [33]。 总之，这些结果表明Cdk5可以在细胞环境中磷酸化DRD321的丝氨酸2残基。

缩略图

图2。 Cdk5使细胞中DRD321的第三个细胞内环中的丝氨酸2磷酸化。

使用抗pS5抗体分析Cdk321介导的丝氨酸321的磷酸化。 （A）来自知识产权的样本 细胞/组织 使用GST-D2i3蛋白的激酶测定通过Western印迹（WB）用指定的抗体进行分析。 箭头表示GST-D2i3。 （B）DRD2-GFP和DRD2 S321A-GFP在HEK 5细胞中用或不用HA-Cdk35和p293表达。 使用抗GFP和抗pS321抗体通过蛋白质印迹分析抗GFP免疫沉淀物。 括号表示DRD2信号，空心箭头表示来自抗GFP免疫沉淀物的非特异性信号。 '％输入'是IP反应的总裂解物的体积％。 星号表示弱内源性Cdk5信号。 （C）凝胶迁移率变动分析。 通过Western印迹分析如所示转染的HEK 293细胞。 （D）用喹吡罗处理转染的HEK 293细胞，并用抗GFP和抗pS321抗体通过蛋白质印迹分析抗GFP免疫沉淀物。 空心箭头表示来自抗GFP免疫沉淀物的非特异性信号。

DOI：10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex和DRD2是物理关联的

我们研究了Cdk5 / p35复合物与DRD2之间潜在的物理相互作用，因为已知许多Cdk5底物与Cdk5 / p35复合物物理结合。 [23], [34], [35]。 首先，进行GST下拉实验。 将纯化的重组GST-D2i3蛋白与大鼠脑裂解物一起温育，并分析GST下拉沉淀物的Western印迹。 如图所示 图3A，在下拉沉淀物中鉴定出内源性Cdk5和p35，表明DRD2与Cdk5 / p35复合物之间的物理相互作用（图3A）。 此外，在表达DRD5-GFP和Cdk35 / p293的HEK 2细胞裂解物的抗GFP免疫沉淀物中检测到HA-Cdk5和p35（图3B）。 此外，我们进行了免疫细胞化学分析，并观察到DRD2-GFP，HA-Cdk5和p35在HEK 293细胞的膜区显示出显着的共定位信号（图3C，上图）。 我们还研究了DRD2和Cdk5 / p35在神经元背景下的共定位。 一致地，DRD2-GFP还在培养的纹状体神经元（DIV5）中显示与内源性Cdk35和p7的显着共定位，进一步支持DRD2和Cdk5 / p35之间的功能性连接（图3C，底部面板）。 结果表明DRD2和Cdk5 / p35可形成复合物，因此支持DRD2是Cdk5的生理学底物的观点。

缩略图

图3。 Cdk5 / p35可与DRD2形成复合物。

（A）使用纯化的重组GST-D2i3蛋白与大鼠脑提取物的GST pull-down测定。 将GST下拉沉淀物进行Western印迹分析。 'Bead'表示没有GST蛋白的下拉沉淀物。 （B）DRD2和Cdk5 / p35复合物的免疫沉淀。 将来自转染细胞的裂解物的抗GFP IP进行Western印迹分析。 括号表示DRD2信号，空心箭头表示来自抗GFP免疫沉淀物的非特异性信号。 输入的过度曝光印迹也显示在右侧。 （C）DRD2和Cdk5 / p35的免疫细胞化学分析。 表达DRD293-GFP和Cdk2 / p5的HEK 35细胞用抗Cdk5和抗p35抗体染色（上图）。 DRD2-GFP在培养的纹状体神经元中单独表达，并用抗Cdk5和抗p35抗体染色（下图）。 Hoechst用于细胞核染色。 比例尺为5μm。 使用共聚焦显微镜（Olympus，FluoView-1000）获得所有图像。

DOI：10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5介导的DRD2磷酸化减弱受体活性

据报道，磷酸化调节GPCR的关键特性，如G蛋白偶联，受体内化，细胞内定位以及与调节蛋白的关联。 [9], [11], [24]。 一个激素诱导的受体内化是信号转导的关键调节过程。 我们研究了Cdk5介导的DRD2内化调节。 将表达DRD293-GFP和DRD2 S2A-GFP的HEK 321细胞与或不与Cdk5 / p35一起与1μM喹吡罗一起温育以诱导激动剂刺激的DRD2内化（图4A）。 [3在2 min喹吡罗治疗时，DRD30-GFP表达细胞的H 1 -spiperone信号显着降低，并在90 min恢复。 有趣的是，[3在2 min喹吡罗治疗时，DRD5-GFP和Cdk35 / p30表达细胞的H] -spiperone信号也降低，但在90 min时未恢复（图4A，第二节）。 另一方面， [3表达DRD2 S321A-GFP的细胞的H 1 -spiperone信号在30 min下降低并在90 min恢复，而不管与Cdk5 / p35的共表达。 以前的研究表明，经过长时间的激动剂刺激，内​​化的DRD2会再循环回质膜 [11]。 ţ似乎Cdk5介导的DRD2磷酸化参与激动剂诱导的DRD2内化后的重新敏化过程。

缩略图

图4。 Cdk5介导的磷酸化减弱DRD2表面表达和下游信号传导。

（A）DRD2表面表达[3H] - 螺哌隆结合试验。 用293μM喹吡罗刺激转染的HEK1细胞指定的时间并收获，然后是3 nM [3H]-哌隆处理3小时。 测量放射性并计算表面信号。 误差棒代表平均值±SE（n = 8； * p <0.05，** p <0.01；采用Dunnett事后检验的单向ANOVA：比较所有色谱柱与对照色谱柱）。 （B）[35S] -GTPγS结合试验。 从如所示转染的细胞制备细胞膜。 将膜制剂与1μM喹吡罗一起孵育，然后用3 nM孵育[35S] -GTPγS 90分钟。 误差棒代表平均值±SE（n = 8； * p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001；采用Bonferroni事后检验的单向ANOVA：比较所有成对的色谱柱）。 （C）喹吡罗竞争[3H] - 螺哌隆结合试验。 将来自转染细胞的膜制剂与0.01 nM一起孵育[3H 30-哌隆和增加浓度的喹吡罗3分钟。 非线性回归通过GraphPad获得。 误差棒表示平均值±SE（n = 293）。 （D）在转染的HEK 10细胞中的cAMP酶免疫测定。 将转染的细胞用1 µM咯利普兰预处理0.1 h，然后再用30 µM毛喉素和增加浓度的喹吡罗共处理4分钟。 非线性回归通过GraphPad获得。 误差棒代表平均值±SE（n = 0.01; ** p <XNUMX;两尾 t-tests）。 （E）来自野​​生型和p35敲除胚胎（DIV 7）的培养的纹状体神经元用10μM咯利普兰处理1 h，然后用1μM多巴胺处理1 h。 误差棒代表平均值±SE（n = 4; **p<0.01; 两尾 t-tests）。

DOI：10.1371 / journal.pone.0084482.g004

我们进一步评估了激动剂刺激的G蛋白与Cdk2介导的磷酸化相关的DRD5偶联的潜在变化[35S] -GTPγS结合试验 [25], [26]。 在HEK 2细胞中表达具有或不具有Cdk2 / p321的DRD5-GFP和DRD35 S293A-GFP。 制备膜并用1μM喹吡罗刺激并进一步允许[35S] -GTPγS并入。 表达DRD2-GFP和Cdk5 / p35的细胞膜显着受损[35S] -GTPγ与所有其他细胞膜相比，S结合（图4B）。 这些结果表明Cdk5介导的磷酸化下调DRD2处激动剂刺激的G蛋白结合。

此外，喹吡罗竞争[3进行H 1 -spiperone结合测定以研究Cdk2介导的磷酸化对DRD5的激动剂亲和力的任何潜在变化。 竞争性约束[3测量从转染的膜制剂中增加浓度的喹吡罗处理后的H 1 -spiperone。 竞争结合喹吡罗和[3DRD2-GFP和DRD2 S321A-GFP的H] -spiperone制成类似的logKi 值（DRD9.789-GFP的-2; DRD9.691 S2A-GFP的-321），表明配体对DRD2的亲和力不受DRD5中Cdk2介导的磷酸化的显着影响（图4C).

Cdk5介导的磷酸化下调DRD2-cAMP信号通路

接下来，我们研究了Cdk2对DRD5的修饰是否影响下游信号传导途径。 我们使用cAMP酶免疫测定监测DRD2介导的在表达DRD2-GFP和DRD2 S321A-GFP的细胞中腺苷酸环化酶对毛喉素刺激的cAMP产生的抑制。 表达DRD2的细胞以剂量依赖性方式显示响应于喹吡罗的cAMP水平降低。 值得注意的是，Cdk5 / p35的共表达显着降低了cAMP形成的最大抑制作用（图4D，左图）。 另一方面，在表达DRD2 S321A-GFP的细胞中，无论Cdk5 / p35的表达如何，cAMP形成都对喹吡罗治疗有效抑制（图4D，右图）。 这些结果表明Cdk5介导的DRD2磷酸化减弱了DRD2对下游cAMP信号传导途径的抑制活性。 为了在更加生理学相关的环境中进一步证实这一现象，我们利用了缺乏p35（一种必需的Cdk5激活剂）的敲除胚胎的原代培养神经元。 用1μM多巴胺处理原代培养的纹状体神经元，并通过cAMP酶免疫测定法分析。 当用多巴胺刺激时，来自p35敲除小鼠的神经元与野生型神经元相比表现出降低的cAMP水平（图.4E）。 Ť总之，我们得出结论，Cdk5介导的DRD2磷酸化导致DRD2对cAMP途径的抑制性音调降低。

讨论

我们将DRD2鉴定为Cdk5的新型底物。 磷酸化似乎通过影响受体内化后DRD2的命运来下调DRD2表面表达，从而减少DRD2 Gi- 连接和下游cAMP途径。 由于磷酸化残基S321存在于DRD2长和短同种型中，本研究中提出的机制可能是DRD2介导的信号传导中的一般调节模式。.

中型多刺神经元中的DRD2不仅被认为是主要的多巴胺受体亚型，而且还因其对响应环境刺激的可用性变化的易感性而被认可。 已经广泛研究了激动剂诱导的脱敏和DRD2的重新敏化 [11], [24]. 特别是，许多研究表明慢性精神兴奋剂暴露，如可卡因和安非他明，提高纹状体突触中多巴胺的细胞外水平，伴随着突触后DRD2的动态变化。 [36]. 实际上，已知慢性可卡因使用者在纹状体区域中DRD2水平降低，伏隔核（NAcc）中的DRD2可用性与小鼠和灵长类动物的药物寻求和强化行为呈负相关。 [37]–[39]. 这些发现表明DRD2的功能对于包括慢性药物暴露在内的各种刺激的响应高度易受适应性或补偿性调节的影响。 我们的结果显示DRD321的第三细胞内环中的S2残基可被Cdk5磷酸化，这导致DRD2对cAMP途径的抑制影响降低。 这种相互作用提出了与多巴胺能神经元中的Cdk5相关的新型调节机制，其可能与DRD2表面可用性的动态性质相关。

应当注意，已知Cdk5是介导神经元环境的适应性变化的关键组分。 例如，边缘环路神经元中树突棘的结构和功能改变是反复心理刺激暴露的后果之一 [40]. 这些变化伴随着各种分子变化，包括诱导cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和ΔFosB，转录因子表现出对慢性可卡因给药的持久上调 [41], [42]. 重要的是，Cdk5是ΔFosB的目标 [19], 树突棘动力学中涉及的许多关键成分，如PSD-95，p21活化激酶（PAK），β-连环蛋白和spinophilin，被报道为Cdk5底物 [43]–[46]. 一致地，Cdk5活性的遗传或药理学操作引起树突棘形态的改变和对可卡因的行为反应，暗示Cdk5在中脑边缘多巴胺电路的分子和形态变化中的关键作用。 [47], [48]. 我们的结果显示DRD2是Cdk5的新靶点，提供了对多巴胺系统响应慢性药物暴露的适应性变化的进一步了解，因为随后ΔFosB介导的Cdk5上调可能诱导DRD2磷酸化的强直性增加。 。 此外，已知DRD2会影响多种细胞过程，包括cAMP和MAP激酶途径的调节以及下游转录事件。 [42], [49]. 因此，本研究中的研究结果可能不仅描述了Cdk2对DRD5的直接调节，而且提供了对多巴胺系统对慢性药物暴露的适应性反应的新见解。

作者贡献

构思并设计了实验：JJ YUP DH SKP。 进行了实验：JJ YUP DKK YK。 分析数据：JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP。 贡献的试剂/材料/分析工具：YHS。 写了这篇论文：JJ SKP。

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