Nat Neurosci。 2011 1月; 14（1）：22-24。
在线发布2010十二月5。 DOI： 10.1038 / nn.2703
抽象
背侧纹状体在药物成瘾的发展中起着重要作用; 然而，准确地理解了角色 纹状体（间接） 和striatonigral （直接）途径 调节行为的神经元仍然是难以捉摸的.
使用一种新方法，该方法依赖于病毒介导的工程化GPCR表达（hM4D），我们证明了hM的激活4D受体与氯氮平 - N - 氧化物（CNO）有效降低纹状体神经元兴奋性。 当hM4D受体在大鼠的直接或间接途径神经元中选择性表达，CNO不改变对苯丙胺的急性运动反应，但改变了与重复药物治疗相关的行为可塑性。 特别， 短暂地破坏纹状体上的神经元活动促进了行为致敏，而降低纹状体神经元的兴奋性则削弱了其持续性。 这些研究结果表明，急性药物效应可以通过与重复药物暴露相关的行为适应性进行分析，并强调这种方法可用于解构神经通路对敏感等行为的贡献。
尽管吸毒成瘾具有压倒性的负面影响，但精神兴奋剂的使用和滥用仍然普遍存在。 从最初的药物暴露到常规使用以及最终到强迫性，习惯性行为和抑制性控制的丧失的进展涉及离散神经电路中的一系列分子适应1,2,3。 纹状体已被确定为许多行为和神经生物学适应的关键部位，这些适应性被认为是形成介导成瘾的核心过程1,2,3. 纹状体内的大多数神经元（~95％）是GABA能中型多刺投射神经元（MSN） t帽子的神经肽表达不同，形成两种主要的传出途径4.
- 纹状体疟原虫MSN含有脑啡肽（ENK）并形成间接途径
- 而striatonigral MSNs含有强啡肽（DYN）和P物质并形成直接途径.
许多概念模型假设这些MSN群体在机制和功能上彼此相反5,6. 然而，几乎没有经验证据支持它们在行为控制中的不同作用，因为这些细胞群体在物理上混合在一起并且在形态学上难以区分，使得选择性操作在技术上难以捉摸。
为了检查这些纹状体细胞群在反复暴露于滥用药物后发生的行为的发展中的作用，我们结合了两种新策略：使用ENK或DYN基因启动子将转基因表达靶向纹状体或纹状体神经元的病毒载体。分别和工程化的GPCR（G.I / O- 人类毒蕈碱4 DREADD; 设计师受体由设计师药物独家激活; HM4D)7 由其他药理学惰性配体激活，氯氮平 - N氧化物8,9 （CNO; 图1a，h）。 在培养的神经元中表达后，施用CNO刺激GI / O- 耦合hM4D受体因此激活内向整流钾3（Kir3）通道，导致膜超极化和瞬时神经元沉默9.
为了测试病毒载体的细胞表型特异性，我们在背部纹状体输注病毒后使用双标记免疫荧光显微镜检查（补充图1）表达血凝素标记的hM4在ENK启动子控制下的D受体（pENK-HM4D）或DYN启动子（pDYN-HM4D）。 我们发现pENK-HM4D 表达主要在含有ENK的MSN中（90％的血凝素细胞是ENK +，85来自94; 6％的血凝素细胞是物质P +，4来自70细胞; 图1b）而pDYN-HM4D 表达主要在含P物质的MSN中（血凝素细胞的95％是109细胞中的物质P +，115;血凝素细胞的5％是ENK +，5细胞中的97; 图1i）。 在输注表达绿色荧光蛋白的启动子特异性病毒后获得了类似的结果（pENK-GFP 和PDYN-GFP; SupplementaryFigs。 2a和3a).
鉴于striatopallidal MSN主要投射到苍白球外（GPe）和纹状体神经MSN主要投射到黑质网状（SNpr），我们使用逆行示踪剂Fluoro-Gold注射到这些脑区域，然后进行双标记荧光免疫组织化学确认pENK 和PDYN 病毒产生通路特异性感染。 我们观察到pENK-GFP 在输注到GPe但不输入SNpr后，细胞与纹状体Fluoro-Gold表达共定位（补充图2b）而pDYN-GFP 输注到SNpr而不是GPe后，细胞与纹状体Fluoro-Gold表达共定位（补充图3b）。 病毒载体的表达没有改变病毒感染区域中ENK +或物质P +神经元的数量，表明使用这些启动子进行病毒介导的基因转移不会干扰内源性神经肽水平。 所有这些结果证明了pENK 和PDYN 病毒载体在其适当分离的纹状体细胞群中表达基因。
虽然是hM4已经证明基于D受体的技术调节其他神经元类型的活性9，他们的影响纹状体神经元的能力尚未被研究过。 因此，我们用hM感染纹状体中型多刺神经元4在单纯疱疹病毒（HSV）启动子控制下的D受体，两天后制备冠状背侧纹状体切片，并检查hM如何4D-表达中等刺状纹状体神经元对CNO起反应。 我们观察到局部应用CNO（10μM）诱导膜电位的超极化（~7 mV，基线膜电位调整为-80 mV; 图1c）并减少CNO应用后神经元的输入电阻（图.1d，e），表明在hM中CNO激活钾电导（即Kir3介导的电流）4表达D受体的神经元。 此外，CNO的灌注显着降低了hM中诱发的动作电位的数量4D-表达神经元，但不在对照细胞中，从而有效地抑制病毒感染的神经元的功能输出hM的表达4单独的D受体不会改变输入阻力（P = 0.84）或动作潜在射击（P = 0.64）。 （图.1f，g）。 总之，这些数据表明，类似于海马神经元9，hM4基于D / CNO的方法可有效降低大鼠纹状体神经元的兴奋性。
作为额外的概念证明，我们测试了是否hM4D受体将在完善的回路中阻断神经传递，其中神经活动可由行为相关的刺激可预测地诱发。 因此，我们用hM感染腹侧被盖区（VTA）神经元4在HSV启动子控制下的D受体，其在多巴胺神经元中强烈表达10，并使用快速扫描循环伏安法测量意外传递食物奖励后伏隔核中多巴胺释放的变化11。 与载体相比，施用CNO显着减弱伏隔核中食物颗粒诱发的多巴胺释放（补充图4）。 最后，我们测试了降低纹状体中特定神经元细胞类型的活性 体内 可以改变安非他明刺激Fos表达的能力。 精神兴奋剂，如安非他明，是c-的强力激活剂FOS 在纹状体中12 并会增加c-FOS 在我们的实验条件下，在纹状体和纹状体上都有神经元13。 除了用作神经元活动的标志物外，c-的精神兴奋剂诱导FOS 被认为在与精神运动致敏相关的神经适应的起始和维持中起重要作用1,14。 我们发现CNO介导的p激活ENK-HM4D 受体显着减少了纹状体中苯丙胺诱导的c-Fos细胞总数（图1k 和 补充图5a）。 这种减少发生在血凝素阳性神经元（即表达hM的那些神经元）中4D受体）和血凝素阴性神经元（即那些不表达hM的神经元）4D受体; 图11），提示hM之间的神经元串扰效应4表达D的神经元和未感染的神经元。 当hM时，也观察到苯丙胺诱发的c-Fos细胞总数和血凝素阳性c-Fos细胞数量的显着减少4D受体在直接途径神经元中被激活（图1n，o 和 补充图5b）。 重要的是，这些效应不仅仅是由于p表达的新受体的病毒表达引起的ENK-HM4D 或者pDYN-HM4D 没有CNO处理的受体对安非他明诱发的Fos细胞数量没有影响（补充图 6和7）。 因此，这些发现证明了CNO介导的hM活化4D受体还可通过减少神经递质释放和减弱细胞内信号传导而导致神经元活性降低。
反复接触成瘾药物可导致行为反应性的逐步和持续增加，通常称为行为致敏。 重要的是，致敏涉及与人类药物成瘾的发展有关的一些相同的神经回路3。 在这里，我们使用我们的新工具来研究电路特异性抑制纹状体神经元活动对苯丙胺致敏发展的影响。 我们假设直接和间接途径神经元具有相反的作用，其中纹状体神经元促进致敏和纹状体动物神经元抑制致敏，这与它们在行为激活和抑制中的概念提出的作用一致。5,6。 因此，我们测试了生物化学降低纹状体感受神经元的神经元兴奋性是否会诱导对苯丙胺给药方案的致敏，其引起致敏的阈值水平以及降低纹状体神经元的神经元兴奋性是否会阻止通常产生强烈致敏的方案中的致敏作用。
对于第一项研究，我们使用了一种治疗方案，该方案在GFP对照中诱导阈值水平的运动致敏（四种药物暴露）。 在停药期后，在不存在CNO诱导的神经元活性减弱的情况下施用中度攻击苯丙胺剂量（2 mg / kg）以确定致敏是否持久。 CNO介导的p激活ENK-HM4D 安非他明治疗期间的受体并未改变对安非他明的急性运动反应（图2a）。 然而，与GFP对照相比，CNO介导的间接途径神经元中神经元活动的破坏促进了显着更强的致敏性的发展（图2b）。 这种增强的敏化作用保持在安非他明的攻击上，这是在没有CNO处理的情况下一周后进行的（图.2c，d）。 这些效应可归因于hM对纹状体感受神经元活性的CNO依赖性降低4D受体因为hM4没有CNO治疗的D受体表达不会对这种温和的安非他明给药方案产生运动致敏（补充图6).
为了确定纹状体神经元是否能够以相反的方式调节药物反应性，我们接下来测试了在苯丙胺的药物治疗方案中生物化学降低背内侧纹状体中纹状体神经元的兴奋性的效果，该方案在GFP对照中产生强烈的致敏性（六种药物暴露） ）以及在缺乏受体介导的神经元活动破坏的苯丙胺（0.5 mg / kg）的低攻击剂量期间。 与间接途径抑制一样，在安非他明治疗期间，CNO介导的直接途径神经元兴奋性降低并未改变对苯丙胺的急性运动反应（图2e）。 尽管致敏作用的发展似乎与CNO诱导的p激活后的GFP对照相似DYN-HM4D 治疗期间的受体（图2f），敏感性并没有持续到pDYN-HM4D 小组但仍然在GFP控制中得到有力维护（图2g，h）。 这些效应也可归因于hM对纹状体神经元活性的CNO依赖性降低4D受体因为hM4在没有CNO处理的情况下，D受体表达没有阻止运动致敏的发展，因为在治疗期和药物攻击期间观察到致敏（补充图7）。 这些数据表明纹状体神经元可能对于调节长期行为适应特别重要，这是由于重复使用药物的结果。
总之，这些数据为纹状体和纹状体神经元在调节药物经验依赖性行为可塑性中的关键和相反作用提供了第一个证据。。 此外，神经元抑制对苯丙胺急性运动反应的影响缺乏进一步证明，调节对药物的急性反应的机制不同于调节反复药物暴露时发生的持久适应的机制。 最后，将表型特异性病毒载体与能够改变神经元活性而不会永久破坏细胞功能的设计者受体配对，为解构成瘾的分子基础提供了一种新颖而有力的方法。
致谢
这项工作得到NIH资助K99 DA024762（SMF），T32 GM07266和T32 GM07108（DE），T32 AA009455和F32 DA026273（MJW），R21 DA021793（PEMP），R01 DA023206（YD），U19MH82441和NIMH-PDSP（BLR ）和R21 DA021273（JFN），大学科学家的成就奖励（DE）和NARSAD杰出研究员奖（BLR）
参考资料
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