De nombreuses études portant sur le marqueur d'activité neurale Fos indiquent que la cocaïne n'active qu'une faible proportion des neurones striataux peu répartis. Jusqu'à présent, aucune méthode efficace n'était disponible pour évaluer les neuroadaptations induites spécifiquement au sein de ces neurones activés. Nous avons utilisé le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) pour purifier les neurones striataux activés au cours de la locomotion induite par la cocaïne chez les patients naïfs et sensibilisés à la cocaïne. cfos-lacZ rats transgéniques. Les neurones activés ont été marqués avec un anticorps dirigé contre la β-galactosidase, le produit protéique du gène lacZ. CL'ocaïne a induit sélectivement un profil d'expression génique unique dans la faible proportion de neurones activés qui n'a pas été observé dans la majorité des neurones non activés. Ces gènes comprenaient des niveaux modifiés des gènes précoces immédiats arc, fosBet nr4a3, ainsi que des gènes impliqués dans la signalisation et la spécificité de type cellulaire p38 MAPK. Nous proposons que cette méthode FACS puisse être utilisée pour étudier les neuroadaptations moléculaires dans des neurones spécifiques encodant les effets comportementaux de drogues maltraitées et d'autres comportements appris.

Animaux

Femme cfos-lacZ rats transgéniques (Kasof et al., 1995; Koya et al., 2009) et des rats femelles Sprague-Dawley (Charles River, Raleigh, Caroline du Nord, États-Unis) ont été logés individuellement dans des cages en plastique standard dans une pièce à température et humidité contrôlées. Ils ont été maintenus sur un cycle de rétro-éclairage 12: 12 h: obscurcissement (éclairage allumé à 20.00 h) et ont permis un libre accès à la nourriture et à l'eau. Ils ont été acclimatés à ces conditions de logement pendant un minimum de 7 jours avant le traitement. Les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux NIDA.

Traitements médicamenteux

Pour les expériences de cocaïne aiguë, les rats ont reçu une injection de cocaïne (30 mg / kg, ip; n = 8) ou de solution saline (1 ml / kg; n = 6) et ont été placés dans une chambre ronde en plexiglas (38 cm de diamètre). Les rats ont été sacrifiés 90 quelques minutes après les injections pour obtenir un tissu cérébral. Ce traitement a été répété trois fois différents jours pour obtenir trois réplicats biologiques pour l'analyse par micropuce. En outre, trois réplicats biologiques indépendants ont été produits de manière similaire pour la PCR quantitative (qPCR). Pour les analyses qPCR de arc, pdyn, adora2a, seules ces trois répliques biologiques indépendantes ont été utilisées. Pour les analyses qPCR de fosB, nr4a3, kcnc1 et map2k6, nous avons également utilisé l’ARN restant de chacun des échantillons de micropuces.

Lors d'expériences répétées sur la cocaïne, les rats femelles ont été sensibilisés avec quatre injections de cocaïne (15 mg / kg ip) administrées une fois tous les deux jours. Les jours d'injection, chaque rat a été placé dans une chambre d'activité locomotrice en plexiglas carrée 43 × 43 cm (Med Associates, St Albans, Vermont, Etats-Unis) pour s'habituer aux minutes 30. On injecte de la cocaïne à des rats et on enregistre l'activité locomotrice en tant que distance parcourue pendant X minutes 60. Après la quatrième injection répétée de cocaïne, les rats sont restés dans leur cage d'origine pendant les jours 7 – 8. Le jour du test, les rats ont été habitués à 30 min dans les chambres d’activité locomotrice, puis une injection de cocaïne (30 mg / kg ip) ou de véhicule salin a été administrée. Les rats ont été décapités et les cerveaux ont été extraits 90 minutes après les injections. L'ensemble du traitement de sensibilisation a été répété trois fois au cours de semaines différentes pour obtenir trois réplicats biologiques de chaque groupe pour l'analyse qPCR.

Dissociation cellulaire

Le tissu strié a été dissocié pour obtenir une suspension monocellulaire. Les rats ont été décapités et leur striata extrait en deux minutes. Chaque striatum a été émincé avec des lames de rasoir sur une plaque de verre glacée et placé dans 1 ml d'Hibernate A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striata a été soumis à une digestion enzymatique dans 1 ml d'Accutase per striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) avec un mélange final pour 30 min à 4 ° C. Le tissu a été centrifugé pendant deux minutes à 425 × g et remis en suspension dans 300 ul de Hibernate A glacé. Toutes les étapes de centrifugation ultérieures ont été effectuées à 4 ° C.

Le tissu striatal digéré était mécaniquement dissocié par trituration. Quatre striata ont été combinés dans un tube d'Eppendorf et triturés dix fois avec une pipette Pasteur de grand diamètre (~ 1.3mm). Les tubes ont été brièvement placés sur la glace pour permettre aux gros morceaux de tissus de se déposer; 600 ul d'une suspension trouble contenant des cellules dissociées ont été transférés dans un tube 15 ml Falcon sur de la glace. 600μL d'Hibernate A frais ont été ajoutés au tube Eppendorf d'origine, puis les étapes de trituration ont été répétées comme ci-dessus avec des pipettes de diamètre moyen et faible (~ 0.8mm et ~ 0.4mm). Chaque suspension trouble contenant des cellules dissociées a été regroupée avec la suspension précédente.

Les amas de cellules restants dans la suspension de cellules regroupée ont été éliminés par filtration sur des tamis de cellules 100 um et 40 pré-mouillés (marque Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Les petits débris cellulaires dans la suspension ont été réduits par centrifugation du filtrat pendant 3 min à 430 × g sur un gradient de densité en trois étapes de Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). La couche supérieure trouble (environ 2 ml) contenant des débris a été jetée. Les cellules dans les couches restantes ont été remises en suspension dans la solution de Percoll restante et centrifugées pendant cinq minutes à 550xg. Le culot a été remis en suspension dans 1 ml d'Hibernate A.

Immunomarquage et FACS

Les cellules dissociées ont été fixées et perméabilisées en ajoutant un volume égal d'éthanol pour une concentration finale en% d'éthanol 50 et maintenues sur de la glace pendant quelques minutes 15 avec mélange occasionnel. Les cellules ont été centrifugées pendant deux minutes à 425xg et remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate sans RNase (PBS). Les cellules ont été incubées avec un anticorps primaire biotinylé contre NeuN (dilution 1: 1000, Cat # MAB377B, Chemicon) et un anticorps primaire contre la β-galactosidase (β-gal; dilution 1: 10000, Cat. 4600, Biogenesis, Poole Royaume-Uni). Les cellules ont été retournées dans un anticorps primaire pendant quelques minutes à 1409 à 30 et centrifugées pendant trois minutes à 4xg. Les cellules ont été lavées avec 425 ul de PBS et remises en suspension dans 800 ul de PBS. avec de la streptavidine marquée à la fluorescence (streptavidine-phycoérythrine, 700: dilution 1, Cat # SA1000-1004, Invitrogen, Carlsbad, CA) et un anticorps secondaire (Alexa Fluor 1 marqué IgG, 488: 1: XnX dilution, 1000, Invitrogen) et rotation après extrémité pour 11055 minimum Les cellules ont été lavées avec 15 ul de PBS, centrifugées pendant trois minutes à 800xg et remises en suspension dans 425 ml de PBS.

Les cellules immunomarquées ont été scannées et triées au centre de cytométrie en flux Johns Hopkins Bayview Campus. Un Aria FACS (BD, Franklin Lakes, NJ) a été utilisé pour le tri cellulaire. Les échantillons de contrôle ont d'abord été analysés pour déterminer les critères optimaux de tri des échantillons à tester. Spécifiquement, des cellules fixées sans traitement par anticorps ont été utilisées pour définir la porte de diffusion de la lumière. Les cellules fixées traitées avec un anticorps secondaire fluorescent, mais pas avec un anticorps primaire, ont ensuite été utilisées pour fixer des seuils de fluorescence des tissus endogènes et de liaison non spécifique par la streptavidine ou un anticorps secondaire. Ensuite, des échantillons de contrôle portant un seul anticorps primaire et secondaire pour chaque protéine (NeuN ou β-gal) ont été utilisés pour compenser le chevauchement de la fluorescence dans les canaux voisins. Enfin, les échantillons de test marqués avec les deux marqueurs fluorescents ont été analysés et triés. Les cellules triées ont été collectées dans des tubes à faible liaison (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) avec 100 ul de PBS dans chaque tube.

Extraction d'ARN

Après le tri, des échantillons contenant des cellules soit βgal positives, soit négatives, de rats injectés de cocaïne ou toutes les cellules NeuN positives de rats injectés de solution saline ont été centrifugés pendant 8 min à 2650 × g à 18 ° C. Les cellules NeuN-négatives de rats ayant reçu une injection de solution saline ont été centrifugées pendant 8 min à 6000 ×g à 18 ° C. Pour les expériences sur puces à ADN, l'ARN a été extrait avec le réactif Trizol (Cat # 15596-026, Invitrogen) conformément aux instructions du fabricant. La qualité et la quantité d'ARN ont été évaluées à l'aide du Bioanalyzer Picochip (Cat. 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, Californie). Pour les expériences de qPCR, l'ARN a été extrait avec le kit RNEasy Micro (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) conformément aux instructions du fabricant avec traitement à la DNase. La quantité et la pureté de l'ARN ont été évaluées à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Expériences de puces à ADN

Des puces à ADN ont été utilisées pour analyser l'ARN de cellules NeuN-positives et NeuN-négatives de rats injectés de solution saline, ainsi que de neurones βgal positifs et βgal-négatifs de rats injectés de cocaïne. Comme décrit ci-dessus dans la section sur le traitement du médicament, les microréseaux contenaient trois réplicats biologiques pour chacun des quatre types d'échantillons. Cinq µl d’ARN total de chaque échantillon ont été marqués à l’aide du kit d’Amplification d’ARN Illumina TotalPrep (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) dans un processus en deux étapes de synthèse d’ADNc suivi de in vitro Transcription d'ARN avec biotine-16-UTP. 0.75 μg d'ARNc marqué à la biotine a été hybridé pendant 16 heures avec le Ref12_v1 BeadChips de Illumina Sentrix Rat (n ° de cat. BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). L'ARNc biotinylé hybridé à la puce a été détecté avec de la streptavidine marquée au Cy3 et quantifié à l'aide du scanner BeadStation 500GX de Genetic Analysis Systems d'Illumina. Tous les étiquetages et analyses ont été effectués au centre de génomique de la famille Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe.

PCR quantitative en temps réel

Une PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour valider les résultats du FACS et du microréseau. La transcription inverse de l'ARN en ADNc a été réalisée à l'aide du kit RETROscript (Cat # AM1710, Ambion) avec un amorce oligo (dT). Chaque réaction PCR 25 μl comprenait 12.5 μl du mélange maître d’expression de gènes Taqman (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, Californie), 1.1 μl de chacune des amorces directe et inverse 20 μM, 0.25 μl de la sonde FAM marquée 100 μM, 5 μl d’eau et 5 μl d’ADNc de 1 ng / μl. Combinaisons d’apprêt et de sonde [Tableau 1] ont été conçus à l’aide du centre de conception de tests de la bibliothèque de sondes universelles Roche afin de couvrir les introns. Les réactions de PCR ont été surveillées en utilisant l’Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Le programme a commencé par une lecture de plaque 20 à 50 ° C pour le photoblanchiment, suivie par 5 min à 95 ° C, puis par des cycles 40 de 20 sec à 94 ° C, 1 min à 60 ° C et une lecture sur plaque.

 

Tableau 1

Amorces et sondes utilisées pour la qPCR

Les réactions de courbe standard ont d'abord été effectuées pour chaque gène afin de déterminer l'efficacité de l'amplification [Tableau 1]. Les niveaux d’expression de chaque gène amplifié ont été calculés en utilisant l’efficacité ^ ΔC_q où ΔC_q = C_q(gène expérimental) - C_q(gène de référence) pour chaque réplicat biologique. Gorasp2 a été choisi comme gène de référence parce qu’il n’était pas exprimé différemment entre neurones et cellules gliales dans les analyses par micropuce. Il a ensuite été validé comme gène de référence en raison de la même amplification de la qPCR dans tous les échantillons lors du chargement de la même quantité de matrice. Essai technique en trois exemplaires C_q les valeurs ont été moyennées avant le calcul de ΔC_q pour chaque gène dans un échantillon. Pour chaque ARNm mesuré en qPCR, les valeurs d'expression génique ont été moyennées sur des réplicats biologiques. Ensuite, pour refléter les valeurs de changement de pli, nous avons divisé cette moyenne par les valeurs moyennes d'expression des gènes de cellules NeuN-positives provenant de rats injectés avec une solution saline. Ces valeurs sont indiquées sous forme de moyenne et d'erreur type dans les graphiques et les tableaux.

Immunohistochimie

Le tissu cérébral a été obtenu chez des rats femelles Spraque-Dawley de type sauvage après les mêmes traitements à la cocaïne aigus et répétés que ceux décrits ci-dessus pour les expériences sur microréseau et qPCR. Cependant, quelques minutes après les injections du jour du test, les rats ont été anesthésiés profondément avec de l’isoflurane et perfusés avec 90 ml de PBS suivis de 100 ml de 400% paraformaldéhyde (PFA). Les cerveaux ont été post-fixés dans le PFA pendant 4 heures et transférés dans une solution 2% saccharose à 30 ° C pendant 4 – 2 jours. Les cerveaux ont été congelés sur de la neige carbonique en poudre et maintenus à -3 ° C jusqu'à la coupe. Des coupes coronales ont été coupées 80 µm d'épaisseur entre Bregma 40 et -2.5 (Paxinos et Watson, 1998).

Les sections étaient immunomarquées pour Fos et Arc. En bref, les sections ont été lavées trois fois dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) et perméabilisées pendant 30 min dans du TBS avec 0.2% Triton X-100. Les coupes ont été lavées à nouveau dans du TBS et incubées dans des anticorps primaires dilués dans du PBS avec% de Triton X-0.3 100 pendant 24 heures sur un agitateur à 4 ° C. Nous avons utilisé un anticorps polyclonal de lapin contre c-Fos (1: dilution 500, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie) et un anticorps monoclonal de souris Arc (1: 100 dilution, Cat # sc-17839, Santa Cruz Biotechnology). Les coupes ont été lavées trois fois dans du TBS et incubées dans des anticorps secondaires dilués dans du PBS pendant 1.5 heures sur un agitateur à température ambiante. Nous avons utilisé l'anticorps anti-lapin d'âne marqué Alexa Fluor 488 (1: 200 dilution, Cat # A21206, Anticorps anti-souris de chèvre marqués par Alexa Fluor 568 (1: 200 dilution, Cat # A11004, Invitrogen). Les coupes ont été lavées dans du TBS, montées sur des lames revêtues de chrome-alum et recouvertes d'un support de montage dur VectaShield.

Des images fluorescentes de l'immunoréactivité de Fos et de l'Arc dans le caudate-putamen et le NAc (environ 2.0 mm antérieur à Bregma) ont été capturées à l'aide d'une caméra CCD (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) fixée à un microscope Zeiss Axioskop 2. Les images pour compter les cellules marquées ont été prises à un grossissement 200x; des images pour déterminer la colocalisation de Fos et Arc ont été prises au grossissement 400x. Les cellules étiquetées de quatre hémisphères par rat ont été comptées automatiquement à l'aide du logiciel IPLab pour Macintosh, version 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Les comptes des quatre hémisphères ont été moyennés pour obtenir une valeur unique pour chaque rat.

L'analyse des données

Les données de sensibilisation locomotrice ont été analysées en utilisant une ANOVA à un facteur avec des mesures répétées pour l'effet principal du temps sur 4 jours d'injection. La signification statistique a été fixée à p <0.05. Les données des puces à ADN ont été analysées à l'aide de DIANE 6.0, un programme d'analyse de puces à ADN basé sur un tableur basé sur SAS JMP 7.0, comme décrit précédemment (Garg et al., 2009). Les données d’intensité de fluorescence provenant de puces à ADN ont été filtrées par détection p-values ​​et Z normalisation. La qualité de l’échantillon a été analysée à l’aide des diagrammes de dispersion, de l’analyse en composantes principales et de l’échantillon de gène. Z-Classement hiérarchique basé sur les scores pour exclure d'éventuelles valeurs aberrantes. Des tests ANOVA ont ensuite été utilisés pour éliminer les gènes présentant des variances plus importantes dans chaque groupe de comparaison. Les gènes ont été identifiés comme exprimés différentiellement si p <0.01, valeur absolue Z-ratio ≥ 1.5 et rapport de fausses découvertes (fdr) <0.07. Pour les données de qPCR, une ANOVA à un facteur a été utilisée pour comparer les données pour chaque gène. La signification statistique a été fixée à p <0.05. Pour l'immunohistochimie de Fos et Arc, un test t supposant une variance inégale a été utilisé pour calculer la signification statistique, fixée à p <0.05.

rats transgéniques cfos-lacZ

La cfos-lacZ le transgène chez ces rats est régulé par un c-fos promoteur similaire à celui de l'endogène c-fos et est donc activé de manière similaire dans les neurones par des niveaux élevés d’entrée synaptique excitatrice (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993; Sgambato et al., 1997). Le produit protéique du cfos-lacZ transgène, la β-galactosidase (βgal), est co-exprimée avec le c-Fos dans les neurones fortement activés (Koya et al., 2009) et utilisé pour marquer les neurones striataux activés dans la procédure de purification FACS suivante.

FACS purification de neurones striataux activés après une seule injection de cocaïne aiguë

Des striata entiers ont été obtenus à partir de cfos-lacZ Les rats 90 minutes après les injections aiguës de 30 mg / kg de cocaïne ou de solution saline en dehors de leur cage d'origine. Les cellules striatales dissociées provenant de rats traités de la même manière ont été regroupées avant la purification par FACS pour chacune des réplications biologiques dans des analyses ultérieures sur microréseau et PCR quantitative (qPCR). Les cellules striatales dissociées ont été initialement analysées selon leurs caractéristiques de diffusion de la lumière avant et latérale [Figure 1a]. La majorité des neurones marqués au NeuN ont été trouvés dans une bande d'événements le long de la partie inférieure de la parcelle. Ainsi, toutes les analyses ultérieures ont été déclenchées de manière à n'inclure que les événements trouvés dans cette bande.

 

Figure 1

Tri cellulaire activé par fluorescence de neurones marqués βgal de rats traités avec une seule injection de cocaïne

Les cellules situées dans cette porte ont été séparées en fonction de leur degré d'immunomarquage avec le marqueur neuronal NeuN et le marqueur d'activation neurale βgal. Dans les tissus obtenus à partir de rats ayant reçu une injection de cocaïne, environ 15% des neurones marqués au NeuN présentaient des taux élevés de βgal [Figure 1b], ce qui correspond à peu près à des neurones marqués 100,000 βgal par rat. Toutes les cellules marquées par βgal coexprimaient NeuN, indiquant que seuls les neurones exprimaient βgal. En revanche, très peu de neurones marqués au NeuN obtenus à partir de rats ayant reçu une injection de solution saline ont exprimé les marqueurs d'activation βgal ou Fos, qui prennent en charge l'immunoréactivité de βgal et Fos en tant que marqueurs de l'activation neurale chez des rats soumis à une injection de cocaïne. Le faible nombre de neurones exprimant βgal de rats injectés avec une solution saline ne fournissait pas assez de cellules pour les analyses moléculaires ultérieures. Ainsi, nous avons utilisé uniquement le marquage NeuN pour séparer les cellules neuronales des cellules non neuronales dans toutes les expériences ultérieures avec du tissu striatal obtenu à partir de rats ayant reçu une injection de solution saline. Dans l'ensemble, environ 30% de tous les corps de cellules striatales étaient NeuN-positifs, ce qui correspond à environ neurones striataux 600,000 par rat. Lorsque les cellules purifiées par FACS ont été examinées par microscopie à fluorescence, toutes les cellules étaient rondes et dépourvues de processus [Figure 2]. L'observation microscopique a confirmé que les cellules triées par FACS étaient correctement marquées pour l'immunoréactivité NeuN- et βgal. Les échantillons de cellules purifiées par FACS se sont révélés purs à> 90% lorsqu'ils sont évalués avec un deuxième cycle de cytométrie en flux (données non présentées).

 

Figure 2

Photos au microscope de cellules et de débris purifiés par FACS

Nous avons déterminé la sélectivité de notre procédure de purification FACS avec un microréseau pour analyser les profils d'expression des gènes des cellules purifiées par FACS. Nous avons comparé l'expression des gènes dans les neurones βgal positifs et βgal négatifs de rats injectés de cocaïne, ainsi que dans les cellules NeuN positives et NeuN négatives de rats injectés de solution saline. L’analyse en composantes principales et en grappes a montré que le facteur de différenciation principal était de savoir si les cellules étaient des neurones ou des cellules gliales [Figure 3a]. Le deuxième facteur de différenciation était l'expression βgal utilisée pour séparer les neurones activés des neurones non activés. Les gènes ont été identifiés comme exprimés différentiellement si p <0.01, valeur absolue Z-ratio ≥ 1.5 et rapport de fausses découvertes (fdr) <0.07. Nous avons constaté que 125 gènes étaient augmentés et 467 gènes diminués dans les neurones βgal-positifs par rapport aux neurones βgal-négatifs obtenus à partir du même tissu striatal de rats injectés de cocaïne [Figure 3b]. Lorsque les mêmes neurones βgal-positifs de rats injectés de cocaïne ont été comparés à des échantillons témoins de tous les neurones marqués au NeuN de rats injectés de solution saline, 133 gènes ont été augmentés et 890 gènes ont diminué dans les neurones βgal-positifs. Notamment, les deux groupes témoins - les neurones βgal négatifs de rats injectés de cocaïne et tous les neurones marqués au NeuN de rats injectés de solution saline - ont produit des modèles d'expression génique très similaires; l'expression des gènes n'était pas significativement différente entre ces groupes témoins [Figure 3b].

 

Figure 3

Analyse par micropuce de cellules triées à partir de striata de rat après une seule injection de cocaïne ou de solution saline

Des gènes spécifiques trouvés dans les différents groupes d’échantillons ont confirmé la séparation des neurones activés des neurones non activés, ainsi que des cellules neuronales des cellules non neuronales en utilisant la méthode FACS [Tableau 2]. Les neurones βgal-positifs de rats injectés à la cocaïne ont exprimé des taux plus élevés de nombreux gènes marqueurs de l'activation neuronale que les neurones βgal-négatifs des mêmes rats injectés à la cocaïne ou de tous les neurones marqués au NeuN provenant de rats à injection de solution saline [Figure 3c]. Ces gènes marqueurs d'activité inclus c-fos, junB, arc, EGR famille (1, 2, 4), et nr4a3 (Guzowski et al., 2005). Fait intéressant, ces neurones βgal positifs ont également exprimé des niveaux significativement plus élevés du gène de la prodynorphine marqueur de type cellulaire spécifique du récepteur de la dopamine D1 et des taux significativement plus faibles du gène du récepteur de la dopamine D2.

 

Tableau 2

Résumé des données de puces à ADN et de qPCR tirées de l'expérience de cocaïne aiguë.

Les données d'expression des gènes de puces à ADN ont été validées à l'aide de la qPCR. Les gènes marqueurs d'activité FOSB, arcet nr4a3 ont été exprimés à des niveaux plus élevés dans les neurones βgal positifs des rats injectés de cocaïne par rapport aux deux neurones βgal négatifs des mêmes rats injectés de cocaïne et à tous les neurones des rats injectés de solution saline [Figure 4a; données et informations statistiques dans Tableau 2]. Les neurones βgal-positifs ont également exprimé des niveaux plus élevés du gène de la prodynorphine [Figure 4b]. Alors que les neurones βgal positifs présentaient des niveaux d'expression apparemment plus bas pour plusieurs gènes, notamment les récepteurs A2A adénosine, le canal potassique Kv3.1 et les gènes map2k6 / MEKK6, seuls les gènes Kv3.1 et map2k6 / MEKK6 se sont révélés décisivesFigure 4c]. Dans l'ensemble, les altérations de l'expression génique évaluées avec la qPCR étaient presque identiques aux altérations de l'expression génique évaluées par des expériences sur des microréseaux.

 

Figure 4

La PCR quantitative montre un profil d'expression génique différent pour les neurones βgal positifs après des injections aiguës de cocaïne, par rapport aux neurones βgal négatifs des mêmes rats ou à tous les neurones des rats ayant reçu une solution saline.

Pour déterminer si les altérations de l'ARNm dans les neurones activés étaient reflétées au niveau de la protéine, nous avons utilisé l'analyse immunohistochimique de coupes cérébrales coronales de rats femelles de type sauvage à injection de cocaïne et de solution saline [Figure 5]. Ces sections n'ont pas subi de dissociation ni de FACS et, par conséquent, l'analyse immunohistochimique n'a pas été affectée par la dissociation de cellules trouvée dans la procédure FACS. Dans le striatum ventral de rats ayant reçu une injection de cocaïne [Figure 5a], les marqueurs d'activité neuronale Fos et Arc ont été co-exprimés dans les mêmes cellules: 85 ± 4% de toutes les cellules Fos-positives étaient positives à l'arc, alors que 82 ± 3% de toutes les cellules positives à l'arc étaient Fos positives. Les injections de cocaïne ont entraîné une augmentation du facteur 2.7 dans les neurones marqués par Fos et une augmentation du facteur 2.7 dans les neurones marqués par Arc. Dans le striatum dorsal de rats ayant reçu une injection de cocaïne [Figure 5b], 80 ± 2% de toutes les cellules Fos-positives étaient positives à l’arc, alors que 86 ± 3% de toutes les cellules positives à l’arc étaient Fos positives. Les injections de cocaïne ont entraîné une augmentation du facteur 4.4 dans les neurones marqués par Fos et une augmentation du facteur 3.8 dans les neurones marqués par Arc.

 

Figure 5

Fos et Arc sont co-exprimés dans (a) le striatum ventral et (b) le striatum dorsal après une seule injection de cocaïne

FACS purification de neurones striataux activés à partir de rats sensibilisés à la cocaïne

Dans la deuxième expérience FACS, tous les rats ont été sensibilisés avec des injections répétées de cocaïne. L’administration répétée de cocaïne dans la boîte locomotrice a amélioré la locomotion induite par la cocaïne: la locomotion au jour 7 était 180 ± 18 en% de la locomotion 1 au jour (effet principal du temps sur les injections répétées de 4, F_{3, 363} = 24.9, p <0.001), ce qui indique une sensibilisation psychomotrice significative. Sept jours plus tard, le jour du test, de la cocaïne ou une solution saline a été administrée à des rats dans la même boîte locomotrice. Quatre-vingt-dix minutes plus tard, le tissu striatal comprenant NAc a été extrait et les cellules ont été purifiées par FACS en utilisant la procédure décrite ci-dessus.

Les cellules dans la même bande d'événements dépendants de la lumière que dans l'expérience précédente ont été séparées en fonction de leur degré d'immunomarquage avec le marqueur neuronal NeuN et le marqueur d'activation neurale βgal. Dans les tissus obtenus à partir de rats ayant reçu une injection de cocaïne, environ 10% des neurones marqués au NeuN présentaient des taux élevés de βgal [Figure 6], ce qui correspond à peu près à des neurones marqués 60,000 βgal par rat. Toutes les cellules marquées par βgal coexprimaient NeuN, indiquant que seuls les neurones exprimaient βgal. De nouveau, les tissus obtenus à partir de rats ayant reçu une injection de solution saline le jour du test ont produit très peu de neurones exprimant βgal ou Fos, et donc un nombre de cellules insuffisant pour les analyses moléculaires ultérieures. Par conséquent, nous avons utilisé uniquement le marquage NeuN pour séparer les cellules neuronales des cellules non neuronales obtenues à partir de rats ayant reçu une injection de solution saline. Environ 30% de tous les corps cellulaires chez les rats injectés avec une solution saline étaient NeuN-positifs, ce qui, dans cette expérience, correspondait à environ 14 neurones striataux 400,000 par rat.

 

Figure 6

Tri cellulaire activé par fluorescence de neurones marqués βgal de rats sensibilisés exposés à la cocaïne 7 jours après un traitement répété à la cocaïne

Nous avons utilisé la qPCR pour comparer l'expression génique dans les neurones βgal-positifs et βgal-négatifs de rats injectés de cocaïne ainsi que tous les neurones NeuN positifs de rats injectés de solution saline après sensibilisation à la cocaïne. Les neurones βgal-positifs de rats injectés de cocaïne ont exprimé des niveaux plus élevés de trois gènes marqueurs d'activité neurale - FOSB, arcet nr4a3–Par rapport aux neurones βgal-négatifs des mêmes rats injectés de cocaïne et à tous les neurones des rats injectés de solution saline [Figure 7a; données et informations statistiques dans Tableau 3]. Les neurones βgal positifs expriment également un taux plus élevé du gène de la prodynorphine, similaire à celui observé lors de l'expérience d'injection d'une seule cocaïne [Figure 7b]. En revanche, les neurones βgal positifs avaient des niveaux d’expression plus bas pour plusieurs gènes [Figure 7c], comprenant Drd2 codant pour le récepteur de la dopamine D2, et Map2k6 codant la kinase qui active p38 MAPK, de manière similaire à la seule expérience d’injection aiguë de cocaïne. Enfin, les neurones βgal positifs avaient une expression accrue de dusp1, également connu sous le nom de mkp1 [Figure 7c], qui code pour la phosphatase qui inactive p38 MAPK (Sgambato et al., 1998).

 

Figure 7

La PCR quantitative montre un profil d'expression génique différent dans les neurones βgal positifs des rats sensibilisés à la cocaïne, comparés aux neurones βgal négatifs des mêmes rats, ou à tous les neurones des rats stimulés au sérum physiologique.

 

Tableau 3

Résumé des données de qPCR tirées de l'expérience répétée de cocaïne.

Pour déterminer si les altérations de l'ARNm dans les neurones activés sont reflétées au niveau des protéines, nous avons utilisé l'analyse immunohistochimique des coupes cérébrales coronales de rats femelles sensibilisés à la cocaïne de type sauvage après des injections de cocaïne ou de solution saline le jour du test. Dans le striatum ventral de rats ayant reçu une injection de cocaïne, les marqueurs d'activité neurale Fos et Arc ont été co-exprimés dans les mêmes cellules: 90 ± 2% de toutes les cellules Fos-positives étaient positives à l'Arc et 83 ± 2% à toutes les réactions positives à l'Arc. les cellules étaient positives à Fos. Les injections de test à la cocaïne ont entraîné une augmentation du facteur 2.3 dans les neurones marqués par Fos et une augmentation du facteur 2.2 dans les neurones marqués par Arc. Dans le striatum dorsal de rats ayant reçu une injection de cocaïne, 93 ± 2% de toutes les cellules Fos-positives étaient positives à l’arc, et 90 ± 3% de toutes les cellules positives à l’arc étaient positives à Fos. Les injections de test à la cocaïne ont entraîné une augmentation du facteur 4.4 dans les neurones marqués par Fos et une augmentation du facteur 4.5 dans les neurones marqués par Arc. Ainsi, très peu de cellules non-marquées par Fos ont exprimé Arc et très peu de cellules non-marquées par Arc ont exprimé Fos, ce qui confirme nos résultats à partir de cellules triées.

Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros de l'Institut national de lutte contre l'abus des drogues. D. Guez-Barber a reçu le soutien du NIH MSTP TG 5T32GM07205, du numéro de récompense F30DA024931 du National Institute on Drug Abuse et de la chaire de psychiatrie Charles BG Murphy de l’Université de Yale. Nous remercions Joe Chrest pour son excellente assistance technique avec FACS, ainsi que Chris Cheadle, Tonya Watkins et Alan Berger pour leur travail sur le microréseau. Nous remercions Yavin Shaham pour ses commentaires utiles sur le manuscrit.

Il n'y a pas de conflits d'intérêts pour les auteurs de ce manuscrit.

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