Abstrakt
Ndryshimet psikostimuluese të spinave të dendritit në neuronet dopaaminoceptive në nucleus accumbens (NAcc) janë hipotezuar si një përgjigje adaptive neuronale që është e lidhur me sjelljet e zgjatur të varësisë. NAcc është i përbërë kryesisht nga dy nënpopullime të dallueshme të neuroneve të mesme të mprehtë që shprehin nivele të larta të receptorëve dopamine D1 ose D2. Në studimin e tanishëm, ne analizuam densitetin e shtyllës së dendritit pas trajtimit kronik të kokainës në receptorët e ndryshëm të D1 ose D2 që përmbajnë receptorët e mesëm në NAcc. Këto studime kanë bërë përdorimin e minjve transgenic që shprehin EGFP nën kontrollin e promotorit të receptorit D1 ose D2 (Drd1-EGFP ose Drd2-EGFP). Pas ditëve 28 të trajtimit të kokainës dhe ditëve 2 të tërheqjes, dendësia e shtyllës kurrizore u rrit në dy neuronet Drd1-EGFP dhe Drd2-EGFP. Megjithatë, rritja e densitetit të shtyllës kurrizore u mbajt vetëm në ditët 1 të Drd30-EGFP-pozitivë pas tërheqjes së drogës. Veçanërisht, rritja e shprehjes ΔFosB u vëzhgua edhe në neuronet Drd1-EGFP- dhe Drd2-EGFP-pozitiv pas 2 ditëve të tërheqjes së drogës, por vetëm në neuronet Drd1-EGFP-pozitiv pas 30 ditëve të tërheqjes së barit. Këto rezultate sugjerojnë se rritja e dendësisë së shtyllës kurrizore të vëzhguar pas trajtimit kronik të kokainës është i qëndrueshëm vetëm në neuronet që përmbajnë receptorët e D1 dhe se shprehja ΔFosB shoqërohet me formimin dhe / ose mirëmbajtjen e spines dendritike në D1 si dhe neuronet që përmbajnë receptorin D2 në NAcc.
Shtegu mesolimbik dopaminergjik përbëhet nga neuronet në zonën tegmentale të barkut që inkorporojnë bërthamën accumbens (NAcc), tuberkulozin e nuhatjes, korteksin prefrontal dhe amigdalën (1), ndërsa neuronet nigrostriatal dopaminergic në substantia nigra (pars compacta) sigurojnë një projeksion në rritje tek striatum dorsal (2). Psikostimulantët ngrenë përqëndrimin synaptik të dopaminës në NAcc: kokainë, duke bllokuar absorbimin e dopaminës nga nyja sinaptike dhe amfetaminën, duke nxitur lirimin e dopamines nga terminalet nervore (3-5). Administrimi i përsëritur dhe i përhershëm i psikostimulantëve rezulton në përgjigje të zgjeruara të sjelljes (sensibilizimi) ndaj efekteve stimuluese akute të këtyre barnave (6-8). Shumica e linjave të provave sugjerojnë se ndryshimet adaptive në zonën tegmentale të barkut - sistemi dopaminergik NAcc janë qendrore për ndryshimet në plasticitetin e përvojës që nënkupton sjelljen e droguar.
Përveç dopaminit, glutamati është i nevojshëm për zhvillimin e sensibilizimit të sjelljes në përgjigje të psikostimulantëve (9, 10). Neuronet me madhësi mesatare (MSNs) në striatumin e ventralit marrin parashikime excitatory glutamatergic nga cortex prefrontal që synapse mbi kokat e spines dendritic. Gjithashtu, MSNs janë objektivi kryesor i aksoneve dopaminergic që synapse mbi qafën e shpinës (1, 11, 12). Prandaj, spines dendritic në MSNs përfaqësojnë ndarje qelizore ku transferimi dopaminergic dhe glutamatergic janë integruar fillimisht.
Dopamina vepron në dy nënfamilitë kryesore të receptorit, nënfamiljën D1 (nëntipe D1 dhe D5) dhe nënfamiljën D2 (nëntipe D2, D3 dhe D4) (13). Në striatum dorsal, studimet anatomike kanë treguar se MSNs striatonigral përmbajnë nivele të larta të receptorëve D1 (së bashku me substancën P dhe dynorphin), ndërsa MSN striatopallidal kryesisht shprehin receptorët D2 (së bashku me enkefalin) (14-17). Parashikimet nga NAcc janë më komplekse sesa në striatumin dorsal, me pjesën shell dhe thelbin e NAcc projektuar në subregionet e ndryshme të pallidum ventral dhe në zonën tegmental ventral dhe substantia nigra (18). Përderisa receptorët e D2 dhe enkefalina janë shprehur shumë në projeksionet e pallidumit të ventralit, receptorët e D1 dhe substanca P janë gjetur të shpërndarë në mënyrë të barabartë në projeksionet e pallidumeve ventrale dhe zonës tegmentale ventrale (19). Studimet e agonistëve dhe antagonistëve selektivë për receptorët e D1 ose D2 treguan se të dy receptorët e D1 dhe D2 janë të nevojshme për ndryshime të sjelljes psiko-stimuluese (20-25). Megjithatë, rolet e këtyre receptorëve duket të jenë të ndryshme. Për shembull, stimulimi i receptorëve të D1 zbut kokainën që kërkon të nxitet nga injeksioni i kokainës së kokainës dhe cues mjedisore të lidhura me kokainën, ndërsa stimulimi i receptorëve të D2 lehtëson rikthimin e kokainës (26-28).
Anomalitë e sjelljes që lidhen me varësinë psikostimuluese janë jashtëzakonisht të gjata. Prandaj, ka pasur një interes të konsiderueshëm në identifikimin e ndryshimeve afatgjata të drogës në nivel molekular dhe strukturor në qarqet nervore të rregulluara nga dopamina dhe glutamati (29-32). Sidomos, ekspozimi afatgjatë ndaj kokainës ose amfetaminës është gjetur të rrisë numrin e pikave të degëve të dendritit dhe spines of MSNs në NAcc (33-35). Këto ndryshime strukturore kanë treguar të vazhdojnë deri në ≈1-3.5 muaj pas ekspozimit të fundit të drogës (30, 35) dhe janë sugjeruar që të jenë në themel të ndryshimeve afatgjata në plasticitetin synaptik të lidhur me ekspozimin psikostimulues.
Qëllimi i këtij studimi ishte shqyrtimi i ndryshimeve strukturore të spinave dendritike të shkaktuara nga kokaina në nënpopullimet e MSN-ve të akumuluara që shprehin receptorët D1 ose D2. Në këto studime, ne kemi përdorur minj transgenic kromozom artificiale bakterore (BAC) që shprehin EGFP nën kontrollin e promotorit D1 (Drd1-EGFP) ose D2 (Drd2-EGFP) receptor dopamine receptor36). Rezultatet tregojnë se, edhe pse rritet dendësia e shtyllës kurrizore ndodh në MSNs që përmbajnë receptorin e D1 dhe MSNs që përmbajnë receptorin D2, dendësia e ndryshuar e shtyllës është e qëndrueshme vetëm në neuronet që përmbajnë receptorin e D1. Për më tepër, ne gjejmë ndryshime të ngjashme në shprehjen e faktorit të transkriptimit ΔFosB, duke sugjeruar që ΔFosB mund të përfshihet në formimin dhe / ose mirëmbajtjen e spines dendritike në D1 si dhe neuronet që përmbajnë receptorin D2 në NAcc.
Rezultatet
Analiza e MSNs në Drd1-EGFP dhe Drd2-EGFP BAC Mice Transgenic.
Modeli i projektimit të MSNs nga striatum dorsal dhe ventral në Drd1-EGFP ose Drd2-EGFP BAC minj transgjenik është karakterizuar përmes analizës së shprehjes GFP (36). Shprehja diferenciale e GFP në MSNs e striatum dorsal korrespondon në përgjithësi me atë të receptorëve endogjen D1 ose D2, përkatësisht (36). Ne analizuam më tej shprehjen diferenciale të GFP në NAcc në Drd1-EGFP ose minj Drd2-EGFP (Fig 1a b). Megjithëse ≈58% e neuroneve në NAcc shprehu GFP në minj Drd1-EGFP (Fig 1a), ≈48% e neuroneve në NAcc shprehur GFP në Drd-2-EGFP minj (Fig 1b). MSN paraqet 90-95% të të gjithë neuroneve në NAcc (12, 37). D1 receptorët janë shprehur vetëm në MSNs, dhe receptorët D2 janë shprehur në MSNs dhe në interneurons cholinergic, të cilat përfaqësojnë 1-3% e neurons striatal (37). Duke marrë parasysh këta faktorë, rezultatet sugjerojnë se, minimalisht, ≈10-15% e MSNs në NAcc ka të ngjarë të shprehin dy receptorët D1 dhe D2.
Analiza e Spines Dendritic në Drd1-EGFP dhe Drd2-EGFP Mice.
Shprehja GFP në minj Drd1-EGFP dhe Drd2-EGFP ishte e dobishme për të njollosur trupat e qelizave neurone. Sidoqoftë, sinjali GFP në dendrit dhe spines dendritik ishte shumë i dobët për të lejuar analizën e tyre pas imunizimit me antitrupa anti-GFP. Dorëzimi balistik i ngjyrave fluoreshente ndërmjetësuara nga grimca është përdorur kohët e fundit për etiketimin e popullatave neurone në një mënyrë të shpejtë dhe efikase (38). Të gjithë neuronet mund të etiketohen duke përdorur këtë teknikë dhe metoda duket të jetë e krahasueshme me ngjyrën Golgi-Cox. Për të analizuar morfologjinë dendrite të neuroneve në NAcc, feta fikse akumuluese u etiketuan me ngjyrën lipofil fluoreshente 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocianin perchlorate (DiI) duke përdorur një armë gjenesh. Një shembull i një MSN të ngjyrosur me DiI është paraqitur në Fig 1c. Nën kushtet e përdorura, ne përgjithësisht vërejtëm neuronet e etiketuar pa asnjë dendrit të mbivendosur nga neuronet e tjera të etiketuara. Në zmadhim më të lartë, mund të vërehet morfologjia e hollësishme e dendritit, duke përfshirë spines dendriti (Fig 1d).
Më pas kemi përdorur një kombinim të etiketimit DiI dhe imunohistokimi për GFP në minj transgjenike Drd1-EGFP ose Drd2-EGFP, e cila u bë e mundur duke përdorur një përqendrim të ulët të detergjentit për permeabilizimin e indeve (shih Metodat). Nëpërmjet krahasimit të kujdesshëm të njollës DiI dhe shprehjes GFP në organet qelizore të MSNs, ne mund të identifikojmë neuronet DiI- dhe GFP-pozitive ose DiI-pozitive dhe GFP-negative në Drd1-EGFP (Fig 2a) ose Drd2-EGFP (Fig 2b) minj. Për studimet e mëposhtme, ne analizuam morfologjinë dendrite vetëm në neuronet DiI dhe GFP-pozitiv nga Drd1-EGFP ose minj Drd2-EGFP.
Rezultatet e Trajtimit të Kokainës Kronike në Rritjen e Dendësisë së Spines në MSN Accumbal duke shprehur Drd1-EGFP ose Drd2-EGFP.
Minjtë Drd1-EGFP ose Drd2-EGFP u injektuan në mënyrë të përsëritur me kokainë (30 mg / kg) ose kripur për katër javë rresht (shih Metodat). Dy ditë (2WD) ose 30 ditë (30WD) pas trajtimit të fundit të drogës, truri u përpunua për etiketimin DiI dhe imunohistokemikën siç përshkruhet më sipër. Një studim i mëparshëm raportoi se trajtimi kronik me amfetamin shtoi dendësinë e shtyllës kurrizore në dendrite distale, por jo proksimale të MSNs në NAcc (35). Prandaj kufizuam analizën tonë te dendritët distal (dmth. Ato me degë të rendit të dytë ose të tretë), duke përfshirë rajonet e terminalit. Kur u analizua në 2WD, dendësia e shtyllës kurrizore u gjet në rritje në MSN-të Drd1-EGFP-pozitiv (128% e grupit të kripur) (Fig 3a c) dhe në një masë më të vogël në neuronet Drd2-EGFP-pozitive (115% e grupit të kripur) (Fig 3 b d). Pas 30WD, rritja e dendësisë së shtyllës kurrizore u mbajt në neuronet Drd1-EGFP-pozitive (118% e kontrollit të kripës) (Fig 3 a c) por jo ne neuronet Drd2-EGFP-pozitive (Fig 3 b d).
Morfologjia e spines dendritike është e ndryshueshme në aspektin e gjatësisë dhe gjerësisë së kokës së shpinës. Prandaj ne zgjodhëm zgjatjen e dendritit në katër klasa të shpinës (stubby, kërpudha, hollë, dhe filopodia) në 2WD nga kokaina (të dhënat nuk janë treguar). Dendësia e llojit të kërpudhave (119.7 ± 4.0%, P <0.01) dhe kurrizat e hollë (120.0 ± 3.4%, P <0.01) u rrit me trajtimin e kokainës në MSNs pozitive Drd1-EGFP, ndërsa dendësia e stubby (182.4 ± 21.6%, P <0.05) dhe gjembat e kërpudhave (122.5 ± 5.0%, P <0.01) u rrit në MSN-të Drd2-EGFP pozitive. Nuk kishte ndonjë rritje të ndjeshme të shtyllave kurrizore në neuronet Drd1-EGFP pozitive ose të gjembave të hollë në neuronet Drd2-EGFP pozitive.
Kokaina kronike shkakton ΔFosB Expression në Drd1-EGFP- ose Drd2-EGFP-Pozitive MSNs në NAcc.
ΔFosB është anëtar i familjes Fos të faktorëve të transkriptimit. Ndërsa administrimi akut i kokainës shkakton një induksion të shpejtë dhe të përkohshëm të disa izoformave Fos në NAcc, ekspozimi i përsëritur ndaj kokainës rrit nivelin e ΔFosB. Për më tepër, rritja e shprehjes ΔFosB vazhdon në NAcc për javë në muaj pas ndërprerjes së ekspozimit të drogës dhe është sugjeruar të përfshihet në rregullimin afatgjatë të shprehjes së gjeneve edhe pas ndërprerjes së drogës (29, 39, 40).
Për të shqyrtuar induksionin e ΔFosB në NAcc nga minjtë Drd1-EGFP ose Drd2-EGFP pas trajtimit të kokainës, ne analizuam shprehjen FosB dhe GFP duke etiketuar dyfish (Fig 4 Tabela 1) Antitrupi anti-FosB njeh të gjitha format e FosB, por ne supozojmë se imuniteti i rritur paraqet ΔFosB (shih Metodat për diskutim të mëtejshëm). Në minj të trajtuara me kripë, 16% e neuroneve Drd1-EGFP-pozitiv dhe 15% e neuroneve Drd2-EGFP-pozitive shprehën imunoreaktivitetin FosB me intensitet relativisht të dobët (Fig 4 a b Tabela 1). Trajtimi i përsëritur i kokainës i ndjekur nga 2WD rezultoi në një rritje të konsiderueshme të numrit të neuroneve Drd1-EGFP-pozitive që coexpressed ΔFosB (55% e GFP-positive neurons) (Fig 4c Tabela 1). Një rritje më e vogël, por ende e rëndësishme në shprehjen ΔFosB u gjet në neuronet Drd2-EGFP-pozitive (25% e GFP-pozitive neurone) (Fig 4d Tabela 1). Ashtu si me ndryshimet në dendësinë e shtyllës kurrizore, rritja e shprehjes së ΔFosB u ruajt në neuronet Drd1-EGFP-pozitive (46% e GFP-pozitiv neurone), por jo në neuronet Drd2-EGFP-pozitive (15% e GFP-pozitive neurone) 30WD (Fig 4 e f Tabela 1). Vini re se rritja e shprehjes ΔFosB vërejtur në Fig 4f është prezent në neuronet Drd2-EGFP-negative.
Diskutim
Përshtatjet afatgjata në neurotransmision dopaminergjik besohet të jenë bazë e sjelljeve të varësisë të shoqëruara me droga psikostimuluese. Në veçanti, rritjet psostimuluese të dendësisë së shpinës dendrite të MSNs në NAcc janë hipotizuar të lidhen me riorganizimin e lidhjes synaptike (30). NAcc është i përbërë kryesisht nga dy subpopulations të dallueshme të MSNs shprehur nivele të larta të receptorëve D1 ose D2 dopamine. Në studimin e tanishëm, ne kemi analizuar dendësinë e shtyllës kurrizore në D1 ose D2 që përmbajnë receptorët që përmbajnë në NAcc pas trajtimit kronik të kokainës. Rezultatet e arritura tregojnë se, edhe pse rritet dendësia e shtyllës së shpinës në MSNX-të që përmbajnë receptorin e D1 dhe MSNs që përmbajnë receptorin D2, ndryshimi i dendësisë së shtyllës është i qëndrueshëm vetëm në neuronet që përmbajnë receptorin e D1. Për më tepër, ne gjejmë një model të ngjashëm të ndryshimeve në shprehjen e faktorit të transkriptimit ΔFosB në D1 dhe D2 që përmbajnë receptorët që përmbajnë MSN.
Këto studime kanë bërë përdorimin e minjve BAC transgenic që shprehin GFP në subpopulations specifike të MSNs nën kontrollin e ose promotor D1 ose D2 receptor. Për më tepër, ne kemi zhvilluar një metodë të dy etiketimit që kombinon imunohistokimi për GFP me etiketimin balistik të neuroneve duke përdorur DiI. Studimet e mëparshme kanë përdorur metodën Golgi-Cox për të analizuar efektin e psikostimulantëve në dendësinë e shpinë (34), dhe metoda DiI e përdorur këtu dha rezultate që ishin në mënyrë sasiore të krahasueshme. Ne kemi zhvilluar metodën e etiketimit të dyfishtë, sepse errësirat Golgi nuk janë në përputhje me imunohistokemizmin. Imunostimi zakonisht kërkon permeabilizimin e indeve me detergjentë, një proces që zakonisht çon në solubilizimin e ngjyrave lipofilike nga membrana (38). Megjithatë, në studimet tona të tanishme, imunostaining GFP nuk kërkonte një përqendrim të lartë të detergjent për permeabilization indeve dhe kështu mund të përdoret në lidhje me etiketimin ngjyrë lipophilic. Metoda jonë e etiketimit të dyfishtë duhet të jetë në përgjithësi e dobishme për studimet e ndryshimeve strukturore në spines dendriti, për shembull kur përdoret për analizën e linjave të minjve transgenic BAC ku GFP shprehet në popullata specifike të neuroneve në korteks (36).
Megjithëse akoma disi e diskutueshme, besohet se receptorët e D1 dhe D2 janë kryesisht anatomike të ndara në indet (striatonigral) dhe indirekt (striatopallidal) striatal projection neuroneve, respektivisht (17, 41). Karakterizimi fillestar i lokalizimit të GFP në minj Drd1-EGFP dhe Drd2-EGFP ishte në përputhje me këtë përfundim (36). Për më tepër, analiza jonë e numrit të neuroneve GFP-pozitive në NAcc nga minj Drd1-EGFP dhe Drd2-EGFP është në përputhje me përfundimin se ≈50% e MSN shprehin vetëm receptorët D1, që ≈35-40% shprehin vetëm receptorët D2, dhe se ≈10-15% coexpress receptorët dy D1 dhe D2. Kjo vlerë e bashkëekspresionit është e ngjashme me atë të nënkuptuar nga studimet e striatumit dorsal që analiza e kombinuar e patch-clamp për neuronet e vetme striatale me teknikat RT-PCR për të izoluar dhe përforcuar mRNA (≈17% ekspresioni i enkefalenit dhe substancës P)42). Duhet të theksohet se studimet tona aktuale nuk adresojnë çështjen e shprehjes së receptorëve D3, D4 dhe D5, as nuk adresojnë çështjen e niveleve të ulëta të shprehjes së receptorëve të D1 në MSN që shprehin nivele të larta receptori D2 ose anasjelltas.
Disa studime të mëparshme kanë ekzaminuar lokalizimin neuronal të shprehjes Fos të nxitur nga psychostimulant dhe rolin e receptorëve D1 dhe D2 (43-45). Këto studime mbështesin përfundimin se Fos dhe ΔFosB induksioni është ndërmjetësuar nga aktivizimi i receptorëve D1. Megjithatë, lokalizimi qelizor i shprehjes Fos ndikohet nga konteksti mjedisor në të cilin administrohen medikamente psikostimuluese (46, 47). Për shembull, amfetamina ose kokaina e dhënë në kafaz shtëpiak nxisin gjenet e menjëhershme të hershme (duke përfshirë Fos) preferencën në substancën e qelizave P-pozitive që coexpress receptorët D1. Në të kundërt, këto barna mund të nxisin shprehjen Fos në të dy D1 dhe D2 receptor-përmbajnë MSNs, kur administrohen në një mjedis të ri. Protokolli i përdorur në studimet tona aktuale nuk përfshinte injeksionin pairing të drogës me ekspozimin ndaj një mjedisi të ri. Megjithatë, nuk mund të përjashtojmë një lloj stresi të varur nga konteksti që është përgjegjës për shprehjen ΔFosB në MSNs që përmbajnë receptorin e D2.
Një karakteristikë e dukshme e rezultateve të pranishme ishte modeli paralel i dendësisë së shpinës në rritje dhe shprehjes ΔFosB. Dendësia e shtrirjes së shpinës dhe shprehja ΔFosB fillimisht kanë ndodhur në MSN që shprehin Drd1-EGFP dhe Drd2-EGFP. Megjithatë, këto ndryshime ishin të qëndrueshme vetëm në receptorët që përmbajnë receptorin D1. Një shpjegim i mundshëm për vëzhgimin se rritja e dendësisë së shtyllës kurrizore dhe shprehjes ΔFosB u gjetën në mënyrë të përkohshme në neuronet që përmbajnë receptorin e D2 është se kjo ndodhi në fraksionin e vogël të MSN që coexpress receptorët D1 dhe D2 dopamine. Kështu, natyra e përkohshme e këtyre rritjeve mund të shoqërohet me efektet antagoniste të aktivizimit të receptorit D2 në rrugët sinjali të varur nga D1 (48). Është me interes që ndryshimet në dendësinë e shtyllës kurrizore dhe shprehjes ΔFosB të jenë të kthyeshme, gjë që mund të pasqyrojë aftësinë e rrugëve sinjalizuese të varur nga receptori D2 për të ndikuar në stabilitetin e ΔFosB.
Vëzhgimi se ka ndryshime paralele në shprehjen e ΔFosB dhe densitetit të shtyllës kurrizore është në përputhje me idenë që ΔFosB është i përfshirë në formimin fillestar dhe në mirëmbajtjen e mëvonshme të spinave dendriti në receptorët e receptorit D1 në NAcc. Shprehja e ΔFosB kontrollohet nga sinjali i sinjalizimit të varur D1 / DARPP-32 / PP1 në MSNs (49). Disa studime kanë treguar se ΔFosB luan një rol të rëndësishëm në veprimet e shpërblimit dhe aktivizimin e lokomotorëve të psikostimulantëve (39), me gjasë duke ndikuar në shprehjen e gjeneve të shumta që përfshijnë receptorët neurotransmetues, proteinat sinjalizuese dhe proteinat e përfshira në rregullimin e morfologjisë neurone (50). Megjithatë, mekanizmat specifikë molekularë të përfshirë në formimin kronik të kokainës të shkaktuar nga spina nuk janë të njohura aktualisht. Studimet tona të mëparshme kanë treguar se infuzion intraaccumbal të Roscovitine inhibitorit Cdk5 zbutte rritjen e dendësisë së shtyllës së shtyllës së kokainës (51). Për më tepër, Cdk5 është një gjen objektiv i synuar për ΔFosB dhe ka qenë i implikuar në ndryshimet adaptive kompensuese të lidhura me trajtimin kronik të kokainës (52). Prandaj, ndryshimi i fosforilimit të varur nga Cdk5 është një mekanizëm i besueshëm që krijon formimin e shtyllës kurrizore të kokainës dhe / ose stabilitetin e shtyllës kurrizore. AKP (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), dhe spinophilin (56) janë substrate për Cdk5 dhe të gjitha janë të përfshira në rregullimin e morfogenezës së shpinë (57-60). Karakterizimi i mëtejshëm i këtyre dhe i substrateve të tjera Cdk5 në spines do të shpresojnë të hedhin dritë mbi mekanizmat e përfshirë në rregullimin e formimit të shtyllës nga psychostimulants.
Metodat
Kafshët.
Minjtë që mbartin një transgjen EGFP nën kontrollin e receptorëve D1 ose D2 dopamine u gjeneruan nga projekti Gensat BAC transgenic (36). Minjtë transgenic përdorur në këtë studim ishin 4-5 javë të vjetra dhe ishin në një sfond Swiss-Webster. Mice u mbajtën në një cikël 12: 12-h dritë / të errët dhe u vendosën në grupe të 2-5 me ushqim dhe ujë në dispozicion ad libitum. Të gjitha protokollet e kafshëve ishin në përputhje me Institutet Kombëtare të Shëndetësisë Udhëzues për Kujdesin dhe Përdorimin e Kafshëve të Laboratorit dhe u miratuan nga Komiteti i Kujdesit dhe Përdorimit të Institucioneve të Universitetit Rockefeller.
Trajtimi i drogës.
Trajtimi kronik i kokainës (30 mg / kg, në ditë) është raportuar të prodhojë një rritje të fuqishme të densitetit të shpinë të MSNs si në thelbin dhe në predhën e NAcc nga miu, por një dozë më e ulët (15 mg / kg) guaska (61). Prandaj ne përdorëm dozën më të lartë të kokainës për të nxitur modifikimin strukturor në të dy pjesët e NAcc. Mice morën një injeksion (ip) të 30 mg / kg kokainë-HCl (ose kripur) çdo ditë për 5 ditë të njëpasnjëshme, pasuar nga ditë pa injeksion 2 dhe kjo procedurë u përsërit për 4 javë të njëpasnjëshme. Injeksionet u kryen në kafazin e shtëpisë. 2WD ose 30WD, truri i miut u përpunua për etiketimin DiI dhe / ose imunohistokemikën.
Etiketimi balistik me ngjyrën fluoreshente DiI.
Mice u anestezuan me 80 mg / kg pentobarbital natriumi dhe u perfunduan transcardially me 5 ml PBS, pasuar me perfuzion të shpejtë me 40 ml të paraformaldehidit 4% në PBS (20 ml / min). Trurit u hoqën shpejt nga kafka dhe u vendosën në 4% paraformaldehyde për 10 min. Fetë e trurit (100 μm) janë etiketuar nga shpërndarja balistike e bojës fluoreshente DiI (Prova molekulare) siç përshkruhet në ref. 38. Një metodë e kombinuar DII etiketimi-imunohistokimi është zhvilluar me një përqendrim të ulët të detergjentit. Seksionet e etiketuara DiI ishin permeabilizuar me 0.01% Triton X-100 në PBS për 15 min dhe më pas inkuboheshin në serum 0.01% Triton X-100 dhe 10% të dhisë normale në PBS për 1 h për të minimizuar etiketimin jo-specifik. Seksionet e indit ishin inkubuar me 1% serum dhie / 0.01% Triton X-100 dhe antitrupat anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA) për 2 h në temperaturë dhome, larë dhe inkubuar në 1: 1,000 hollimi i FITC- antitrupi sekondar i konjuguar (Sondat molekulare). Seksionet u vendosën në rrëshqitjet e mikroskopit dhe mbuloheshin me mjete të montimit. Metoda e etiketimit ballistik lejoi analizën e detajuar të strukturës së shtyllës së dendritit dhe rezultatet e arritura ishin të krahasueshme cilësore dhe sasiore me studimet e mëparshme duke përdorur metodën e impregnimimit Golgi-Cox në feta të trurit të mirave (34). Megjithatë, në dallim nga studimet e mëparshme, ne vërejtëm rrallë spines me dy koka në neuronet e DiI-njollave. Ky ndryshim mund të shkaktohet nga ndjeshmëria e metodave të ngjyrosjes ose ndryshueshmëria e miut (ky studim) kundrejt indeve të miellit (34).
Immunohistochemistry.
Kafshët janë anestetizuar dhe perfunduar siç përshkruhet më sipër. Trurit janë larguar dhe ruajtur brenda natës në 4% paraformaldehyde në 4 ° C. Trurit u transferuan në sukrozë 30% në solucion PBS për kriofrozë. Seksionet koronale (12 μm) u prenë në një mikrotomë të ngrirjes (Leica) dhe pastaj u përpunuan për imunohistokimizëm. Seksionet e trurit ishin permeabilizuar pastaj në 0.3% Triton X-100 në PBS për 15 min dhe shpëlarë dy herë në PBS. Seksionet ishin para-inkubuar në 10% serum dhie normale në PBS për 1 h në 37 ° C, të ekspozuar ndaj antitrupave primarë (të holluar në 1% serum normal të dhisë në PBS) brenda natës në 4 ° C dhe pastaj të shpëlarë në PBS dhe inkubuar me sekondare antitrupat për 1 h në 37 ° C. U përdorën antitrupat e mëposhtëm: anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500, Bioteknologjia Santa Cruz), miu anti-NeuN (Chemicon), anti-GFP lepuri, IgG anti-lepuri konjuguar me FITC dhe rodamamine- konjuguar anti-mouse IgG (Prova molekulare). Për etiketimin e trefishtë (ΔFosB, NeuN dhe GFP), seksionet e trurit u imunizuan fillimisht me antitrup anti-pan FosB dhe antitrupë anti-NeuN dhe pastaj inkubloheshin me antitrupa sekondare (anti-lepuri IgG konjuguar me rodaminë dhe IgG anti-mouse konjuguar me cian ). Seksionet e trurit të dyfishtë të përpunuara u përpunuan më tej për imunizimin e GFP duke përdorur teknologjinë e etiketimit Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Sondat molekulare). Antitrupi anti-pan-FosB është ngritur në terminalin N të FosB dhe njeh ΔFosB dhe FosB (62). Bazuar në studimet e mëparshme që treguan se ΔFosB por jo FosB ose antigjenet e tjera të lidhura me Fos është shprehur stabilisht pas trajtimit kronik të kokainës, supozojmë se rritjet afatgjata në imunoreaktivitet paraqesin shprehje të qëndrueshme të ΔFosB. Sidoqoftë, identiteti i sinjalit immunosorbent FosB i vëzhguar në minjtë e trajtuar me kripëra është i panjohur. Analiza statistikore në Tabela 1 përdorën Studentët t testi.
Analizë e shpinës dendritike.
MSN të veçanta në NAcc u zgjodhën për analiza të shtyllës kurrizore bazuar në disa kritere. (i) Kishte pak ose aspak mbivendosje me qelizat e tjera të etiketuara për të siguruar që proceset nga qelizat e ndryshme nuk do të ngatërroheshin. (ii) Të paktën tre dendrite primare duhet të jenë të dukshme për qelizat që do të përdoren për analizë. (iii) Dendritet distale (dendritet terminalë ose afër dendritit terminal) u ekzaminuan. Dendritet nga të dy MSN-të në thelbin dhe guaskën e NAcc u analizuan. Megjithëse kemi vërejtur MSN me spina të rrallë (tip II me gjemba), ne kemi analizuar vetëm MSN me spina të dendura (tip I me gjemba I). Për të llogaritur dendësinë e shtyllës kurrizore, një gjatësi e dendritit (> 20 μm e gjatë) u gjurmua duke përdorur një mikroskop konfokal (Zeiss LSM 510) me një thjerrë zhytjeje në vaj (× 40). Të gjitha imazhet e dendritit janë marrë në të ndryshme z nivelet (intervalet e thellësisë 0.5-1 μm) për të shqyrtuar morfologjinë e spines dendritike. Të gjitha matjet janë bërë me softuerin e analizës së imazhit metamorf (Universal Imaging, Downingtown, PA). Analiza statistikore përdori testin Kolmogorov-Smirnov.
Protrusions nga dendrites janë klasifikuar në katër lloje në bazë të gjatësisë së tyre siç përshkruhet në refs. 63 64. Daljet e klasës 1, të quajtura edhe protuberanca stubby, ishin <0.5 μm në gjatësi, nuk kishin një kokë të madhe kurrizore dhe nuk dukej se kishin një qafë; klasa 2, ose kurrizat në formë kërpudhash, ishin të gjata ndërmjet 0.5 dhe 1.25 μm dhe karakterizoheshin nga një qafë e shkurtër dhe koka e madhe e shtyllës kurrizore; klasa 3, ose kurrizat e hollë, varionin midis 1.25 dhe 3.0 μm dhe kishin qafë të zgjatur të shtyllës kurrizore me kokë të vogël; klasa 4, ose zgjatimet filopodiale, ishin zgjatime filamentoze të gjata që nuk kishin një kokë të dallueshme kurrizore.
Mirënjohje
Kjo punë u mbështet nga Grant DA10044 nga Shërbimi Shëndetësor i Shteteve të Bashkuara (për PG dhe ACN) dhe nga The Simons Foundation, Fondacioni Peter J. Sharp, Fondacioni Picower dhe Fondacioni FM Kirby.
Shkurtesat
- NACC
- bërthamë accumbens
- MSN
- neuroni mesatar të mprehtë
- BAC
- kromozom artificiale bakteriale
- Drd1
- dopamine receptor D1 nxitur nga nxitësi
- Drd2
- dopamine receptor D2 nxitur nga nxitësi
- dii
- 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocijanin perklorat
- 2WD
- 2 ditë pas trajtimit të fundit të drogës
- 30WD
- 30 ditë pas trajtimit të fundit të drogës.
Referencat
;