PLoS Një. 2013 nëntor 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Burim
Laboratori i Fiziologjisë Sjellore, Shkollë e Shkencave të Shëndetit të Njeriut, Tokyo Metropolitan University, Tokio, Japoni.
Abstrakt
Ushtrimi fizik përmirëson aspekte të shumta të funksionit hipokampal. Në përputhje me nocionin se aktiviteti neuronal është çelësi për promovimin e funksioneve neurone, literatura e mëparshme vazhdimisht ka demonstruar që periudhat akute të stërvitjes ngjallin aktivizimin neuronal në hipokampus. Nxitjet e përsëritura të aktivizimit çojnë në një akumulim të faktorit të transkriptimit ΔFosB, i cili ndërmjetëson plasticitetin nervor afatgjatë.
Në këtë studim, ne kemi testuar hipotezën se drejtimi afatgjatë i rrotave vullnetare shkakton shprehjen ΔFosB në hipokampus dhe ka ekzaminuar çdo efekt potencial të rajonit në kuadër të nënfushatave hipokampale përgjatë boshtit dorso-ventral. Meshkujt C57BL / 6 u mbajtën me ose pa rrota drejtuese për javë 4. Rrotullimi afatgjatë i rrotave ka rritur në mënyrë të konsiderueshme imunoreaktivitetin e FosB / ΔFosB në të gjitha rajonet e hipokampës të matura (dmth., në DG, CA1, dhe nënfushat CA3 të dy hippocampus dorsal dhe ventral). Rezultatet konfirmuan se rrotullimi i drejtpërdrejtë nxiti indikacionin specifik të rajonit të imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB në lëvore, duke sugjeruar që rritja uniforme e FosB / ΔFosB brenda hippocampus nuk është një pasojë jo-specifike e drejtimit. Të dhënat Western blot treguan se rritja e imunotaktivitetit Hippocampal FosB / ΔFosB ishte kryesisht për shkak të rritur ΔFosB. Këto rezultate sugjerojnë se stërvitja fizike afatgjatë është një shkaktar i fuqishëm për induksionin ΔFosB gjatë gjithë hipokampusit, gjë që shpjegon pse stërvitja mund të përmirësojë funksionin e dyfishtë të hipokampusit dorsal dhe ventral. Interesante, ne kemi gjetur se shprehja FosB / ΔFosB në DG ishte pozitivisht korreluar me numrin e dy-kortin-imunoreaktive (dmth., I papjekur) neuronet.
Edhe pse mekanizmat me të cilat ΔFosB ndërmjetëson neurogjenezën e ushtruar nga stërvitja janë ende të paqarta, këto të dhëna nënkuptojnë se neurogjeneza e ushtruar nga stërvitja është të paktën aktivitet i varur. Të marra së bashku, rezultatet tona aktuale sugjerojnë se ΔFosB është një objektiv i ri molekular i përfshirë në rregullimin e plasticitetit hipokampal të nxitur nga stërvitja.
Prezantimi
Ushtrimi jep përfitime të ndryshme në aspektin molekular, strukturor dhe funksional të hippocampus në brejtës [1,2], disa prej të cilave u mbështetën nga studimet njerëzore [3,4]. Megjithatë, mekanizmat që i nënshtrohen ndryshimeve të nxitura nga stërvitja në plasticitetin hipokampal nuk kuptohen mjaftueshëm. Literatura e mëparshme vazhdimisht ka treguar se stërvitja ngjall aktivizimin e hippokampal neuronal në brejtës. Studimet imunohistokemike duke përdorur c-Fos, një shenjë e aktivizimit neuronal të përkohshëm, kanë treguar se vrapimi i detyruar dhe vullnetar ka rritur shprehjen c-Fos në nënpikën e gyrus dentate (DG), CA1 dhe CA3 të hippocampusit të brejtësit [5-7]. Përveç kësaj, një studim i mëparshëm që përdor metodën e rrjedhjes së lazer-Doppler (LDF) ka demonstruar se rutine e butë që drejton rritjen e qarkullimit të gjakut në rajon (rCBF), një shënues alternativ i aktivizimit neuronal, në nënfushat CA1 në mi [8]. Studimet imunohistokemike mundësojnë analiza detale të detajuara specifike pasi ushtrimi ka pushuar, ndërsa LDF mundëson monitorimin në kohë reale të rCBF në një zonë të lokalizuar gjatë stërvitjes. Pavarësisht nga përparësitë dhe kufizimet e secilit studim, këto studime në mënyrë të ngjashme treguan një efekt të periudhave të shkurtra akute të stërvitjes në aktivitetin nervor hippocampal. Këto rezultate sugjerojnë një mekanizëm në të cilin stërvitja e rregullt afatgjatë promovon plasticitetin hipokampal duke nxitur në mënyrë të përsëritur aktivizimin neuronal [9].
Faktori i transkriptimit ΔFosB, një izoformë e shkrirë e FosB-së me gjatësi të plotë, nxitet nga lloje të ndryshme të stimulimeve të përsëritura në rajonet specifike të trurit, ku gradualisht akumulohet për shkak të stabilitetit të tij unik (gjysmën e jetës së javëve)10-12]. Një numër gjithnjë në rritje i provave tregon se nivelet e rritura të ΔFosB ndërmjetësojnë plakjen nervore nervore dhe afatgjatë të sjelljes shoqëruar me stimuj të veçantë [11,13]. Për shembull, administrimi kronik i drogave të abuzimeve, të tilla si kokaina dhe morfina, zakonisht rrit shprehjen ΔFosB në nucleus accumbens, që përfaqëson një nga mekanizmat molekulare nën ndjeshmërinë e rritur ndaj këtyre barnave [11,14,15]. Snë mënyrë të ngjashme me stimujt e tjerë të shpërblimit, duke përfshirë dietë me yndyrë të lartë dhe përvojë seksuale [16,17], lrrotull vullnetare afatgjatë, gjithashtu rriti imunoreaktivitetin e FosB / ΔFosB në bërthamën e bërthamës së miut, duke sugjeruar që drejtimi vullnetar është një shpërblim natyror për brejtësit [18,19]. Megjithatë, për të mirë të njohurive tona, asnjë literaturë nuk ka shqyrtuar nëse ekspozimi i përsëritur ndaj ushtrimit fizik shkakton shprehjen ΔFosB në hipokampus. Meqenëse stërvitja shkakton aktivizimin neuronal në hipokampus, ne supozuam se drejtimi afatgjatë i rrotave vullnetare do të nxiste shprehjen ΔFosB në hipokampus. Ndërsa mekanizmat e saktë me të cilat ΔFosB rregullon plasticitetin hipokampal mbetet e pasigurt, studimet kanë treguar se minjtë që nuk kanë fosB gjen tregojnë dëmtuar neurogenesis hippocampal dhe sjellje në rritje të depresionit [20,21]. unëndeed, stërvitje është e njohur për të rritur neurogenesis dhe kanë veti pronave antidepressant [22-25]. unëf hipoteza jonë është e saktë, ΔFosB do të ishte një objektiv i ri potencial molekular i ndërmjetësuar nga plasticiteti hipokampal i stërngarkuar.
Hippocampus ka gradient anatomike dhe funksionale përgjatë aksit të saj gjatësor (dorso-ventral)26]. Hippocampus dorsal luan një rol kyç në të mësuarit hapësinor dhe kujtesës [27,28], ndërsa hippocampus ventral është përfshirë kryesisht në rregullimin e sjelljeve emocionale [29,30]. Për më tepër, studimet kanë treguar se stimujt fiziologjik nxisin modele të ndryshme të shprehjes c-Fos në pjesë dorsale dhe ventrale të hipokampusit [31-33]. Për shkak se stërvitja përmirëson si dorsal [34-37] dhe funksionet e varur nga hippocampus ventral [24,25,38], është e rëndësishme të ekzaminojmë nëse vënia vullnetare afatgjatë shkakton shprehjen specifike të rajonit të ΔFosB në hippocampus.
Hipoteza kryesore e këtij studimi ishte se drejtimi afatgjatë i rrotave vullnetare do të nxiste shprehjen ΔFosB në hipokampusin e miut. Kjo hipotezë u hetua nga imunohistokimi i FosB / ΔFosB në nënfushat hippocampal dorsal dhe ventral, DG, CA1, dhe CA3, me theks të veçantë në identifikimin e induksionit të zonës specifike. Rezultatet u konfirmuan nga blotting perëndimore, e cila është përdorur për të identifikuar isoform të fosB prodhimet e gjeneve të nxitura në hipokampus. Ne gjithashtu shqyrtojmë korteksin për induksionin FosB / ΔFosB të zonës specifike për të përjashtuar mundësinë që ushtrimi afatgjatë të shtojë në mënyrë jo specifike imunoreaktivitetin FosB / ΔFosB në tru. Së fundi, lidhja korelative midis shprehjes FosB / ΔFosB dhe neurogenesis u hetua si hapi i parë në kërkimin e implikimeve funksionale të induksionit ΔFosB të ushtruar nga stërvitja në rregullimin e plasticitetit hipokampal.
Materialet dhe Metodat
1: Kafshët dhe deklarata etike
Njëzet minj C57BL / 6 meshkuj (8 javë të moshës) janë blerë nga një Breeder tregtar (SLC, Shizuoka, Japoni). Dhjetë minj u përdorën për Experiment 1, dhe dhjetë të tjerë për Experiment 2. Mice u vendosën nën kushte të kontrolluara të temperaturës (22-24 ° C) dhe të lehta (cikli 12 / 12-h dritë / errët, dritë në 0500) dhe u siguruan ushqim dhe ujë ad libitum. Të gjitha procedurat eksperimentale u miratuan nga Komiteti Ekzekutiv i Etikës së Kafshëve të Universitetit Metropolitan të Tokios.
Në çdo eksperiment, pas mbërritjes, minjtë u caktuan rastësisht ose në një grup kontrolli (Kontrolli, n = 5) ose në një grup drejtues (Runner, n = 5). Gjatë javës së parë, të gjitha minjtë u vendosën në kafaze standarde plastike në grupe (5 minj / kafaz) për aklimatizimin fillestar. Pastaj, minjtë Runner u transferuan në një kafaz të pajisur me një timon drejtues (ENV-046, Med Associate Inc., Gjeorgji, VT, SHBA). Për shkak se izolimi social është i njohur për të shtypur neurogjenezën e stërngarkuar në hipokampus [39], Minjtë Runner ishin vendosur si një grup (5 minj / kafaz) për një javë shtesë 4. Numri i rrotullimeve të rrotullimeve u regjistrua çdo mëngjes dhe pesha e trupit (g) u mat javore.
2: Eksperto 1. Ekzaminimi imunohistokemik i shprehjes FosB / ΔFosB dhe neurogjenezës hipokampale
2.1: Perfuzioni dhe përpunimi i indeve
Në mëngjes (0900-1100) pas ditës së fundit të periudhës së ekzekutimit, minjtë ishin thellësisht anestetizuar me natriumin pentobarbital dhe perfshire në mënyrë transkardiale me kripëra të ftohtë. Truri u hoq shpejt dhe u vendos fiksuar në 4% paraformaldehyde në 0.1 M fosfat të buta (pHNUMX) gjatë natës. Truri u krijua më pas në 7.4% sukrozë në PBS dhe u ngrirë deri në përpunimin e mëtejshëm. Seksionet e trurit të koronës (30 μm) të një hemisferi u gjetën duke përdorur një mikrotomë të ngrirjes dhe u mblodhën në PBS me azid natriumi 40%.
2.2: Imunohistokimi
Një seri e seksioneve një në gjashtë u zgjodh rastësisht për imunotimin FosB / ΔFosB. Një seri ngjitur u përdor për etiketimin e doublecortin (DCX), një shënues i neuroneve të papjekur të vërtetuara për vlerësimin e neurogjenezës [40,41]. Pas shuarjes së aktivitetit endogjen peroksidazë me 1% H2O2 në PBS, seksionet pa lundrues ishin para-inkubuar me solucion bllokues që përmban 10% serum normal kali në PBS për 2 h. Pas shpëlarjeve në PBS, seksionet u inkubuan me antitrup polikonal pan-FosB (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) holluar në PBS me 0.5% Triton X-100 dhe 0.5% BSA -BSA) për 24 h në 4 ° C. Një seri seksionesh u inkubuan me anti-DCX poliklonale të dhisë (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) në PBST-BSA për 48 h në 4 ° C. Seksionet u inkubuan më tej me një antitrup të duhur biotiniluar sekondar (anti-lepuri IgG, 1: 1000, AP182B, anti-dhi IgG, 1: 1000, AP180B, të dy antitrupat nga EMD Millipore, Billerica, MA, SHBA) në PBST-BSA për 2 h në temperaturën e dhomës. Seksionet u trajtuan pastaj me kompleks avidin-biotin-peroksidaze (Vectastain ABC peroxidase kit, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, SHBA) për 90 min sipas udhëzimeve të prodhuesit. Antigjenet më në fund u vizualizuan me 0.02% 3,3-diaminobenzidin (DAB) në 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) që përmban 0.01% H2O2. Për FosB / ΔFosB immunostaining, reaksioni u intensifikua me sulfat amoni nikel. Për ngjyrosje DCX, bërthamat e qelizave u kundërvihen me njollë Nissl. Seksionet u montuan në sllajde të veshura me xhelatinë dhe u vendosën mbulesa mbuluese.
2.3: Kuantifikimi i imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB duke përdorur kufizimin e imazhit
Antitrupi pan-FosB i përdorur në këtë studim është ngritur kundër një rajoni të brendshëm që ndahet nga rajoni FosB dhe ΔFosB N-terminal, kështu që nuk mund të diskriminojë në mes të dy izoformave. Prandaj, strukturat me imunitet janë përshkruar si bërthama FosB / ΔFosB immunoreactive (FosB / ΔFosB-ir). Për një kuantifikim të paanshëm të verbër, diapozitivët u koduan para analizës. Atrahi i trurit të miut [42] është përdorur për të identifikuar vendndodhjen e rajoneve të interesit në vijim (ROIs): shtresën e qelizës granulare (GCL) të DG (seksionet 3), shtresën qelizore piramidale të seksioneve CA1 (seksionet 3) dhe CA3 (seksionet 2-3) në hippocampus dorsal (mbyllur në -2.2 mm nga bregma); DG (seksionet 2), CA1 (seksionet 2) dhe CA3 (seksionet 2) në hippocampus ventral (mbyllur në -3.4 mm nga bregma) (Figura 4, majtas). Seksionet kaudale përmbajnë dy pjesë dorsale dhe ventrale të hipokampusit, por pjesa e barkut ishte në shënjestër. Në DG, blades suprapyramidal (DGsp) dhe infrapyramidal (DGip) janë analizuar veç e veç. Kornizë motorike (seksionet 2-3, të mbyllura deri në -0.6 mm nga bregma), korteksin e fuçisë somatosensoriale (seksionet 2-3, të mbyllura deri në -0.6 mm nga bregma), korteks vizueli (seksionet 3, mbyllur deri në -2.9 mm nga bregma), cortex auditory (seksionet 3, të mbyllura në -2.9 mm nga bregma), dhe llambë nuhatje (seksionet 3, mbyllur në + 4.3 mm nga bregma) janë analizuar gjithashtu (Figura 6, majtas).
Imazhet digjitale (2070 × 1548 pixels) të secilës ROI janë marrë duke përdorur një mikroskop optik (BX-51, Olympus, Tokio, Japoni) të pajisur me një kamera CCD (DP-73, Olympus) dhe softuer të imazhit (cellSens, Olympus). zmadhimi objektiv objektiv ishte 10 × për ROI hippocampal dhe 4 × për ROIs kortikal. Për të identifikuar imunoreaktivitetin e moderuar-të fortë FosB / ΔFosB (Figura 1D-G), duke përdorur disa seksione paraprakisht, të dy cilësimet e marrjes së imazhit (intensiteti i dritës, madhësia e ndalimit të fushës, koha e ekspozimit dhe bilanci i bardhë) dhe nivelet e pragut për secilën nga komponentët RGB u optimizuan për ROI hippocampal dhe kortikal. Analiza e mëposhtme u krye pastaj në kushtet optimale (1). ROI u zgjodh nga një poligon i parregullt (Figura 1A, B) (2). Imazhi u kufizua, i cili konvertoi bërthamat FosB / ΔFosB-ir në një ngjyrë të kuqe (Figura 1C-G) (3). ROI% u llogarit në mënyrë automatike si më poshtë:% ROI = (sipërfaqja e konvertuar (në të kuqe) / sipërfaqja totale ROI) × 100.
Për të vërtetuar këtë analizë të indeksimit të imazhit, rajonet 20 u përzgjodhën rastësisht nga zona të ndryshme të trurit me madhësi të ndryshme të rajonit. Përveç kuantifikimit të matjes së imazhit, numri i bërthamave FosB / ΔFosB-ir brenda rajoneve të përzgjedhura u numërua manualisht dhe dendësia e bërthamave FosB / ΔFosB-ir u arrit duke e ndarë numrin e bërthamave FosB / ΔFosB-ir nga matet zona (mm2).
2.4: Kuantifikimi i neuroneve të papjekur DCX-ir në gyrus dentate
Neuronet e papjekur DCX-ir në DG të Runner minjve ishin të bollshme dhe mbivendoseshin, duke e bërë të vështirë numërimin e saktë të numrit diskrete të DCX-ir soma duke përdorur një mikroskop optik. Megjithatë, në një studim të mëparshëm, analiza Sholl për vlerësimin morfologjik tregoi se çdo neuron DCX-ir ka mesatarisht një dendrite të vetme kur matet brenda 40 μm të soma [43]. Prandaj, u zhvillua analiza origjinale e mëposhtme për të mundësuar përcaktimin specifik të rajoneve të DCN-ir neuroneve.
- (1) Një imazh i GCL u projektua në një ekran kompjuteri duke përdorur softuerin e imazhit dhe një lente objektive 40 × (2). Në imazhin e drejtpërdrejtë, një segment i linjës (150 ± 0.1 μm) është tërhequr përgjatë mesit të GCL (Figura 2) (3). Ndryshimi i thellësisë fokale u numërua numri i segmentit të vijës së kaluar DCX-ir dendrit (4). ROIs (DGsp dorsal, dDGsp, DGip dorsal, dDGip, DGsp, vDGsp, DGip e barkut, vDGip) korrespondonin me rajonet ku u analizua imunoreaktiviteti FosB / ΔFosB (5). Në çdo ROI, segmentet e linjës 2-3 u hartuan për seksionin dhe numri i kalimeve ishte mesatarizuar mbi seksionet 2-3 për miun. Për shkak se trashësia e GCL është përafërsisht 60-80 μm, numri i kalimeve duhet të pasqyrojë numrin e DCN-ir neuroneve brenda rajonit të kufizuar të analizuar.
Një imazh përfaqësues i imunitetit të DCX-ir dhe një segment i linjës (150 ± 0.1 μm) i mbuluar për numërimin e numrit të kalimeve me DCX-ir dendritet.
3. Eksperimentoni 2. Identifikimi i FosB / ΔFosB isoformit të shkaktuar nga drejtimi i rrotave
3.1: Perfuzioni dhe përpunimi i indeve
Një grup shtesë i minjve u trajtua si më sipër në Eksperimentin 1. Pas javëve 4 të ndërhyrjes drejtuese, minjtë u perfunduan transcardially me kripëra të ftohtë nën anestezi të thellë. Hippocampus u dissected shpejt dhe të ngrirë me azot të lëngshme, dhe ruajtur në -80 ° C. Hippocampi i çdo miu u homogjenizua në tampon RIPA (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% deoksikolat natriumi, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA) frenuesit (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Gjermani). Lysatet u centrifuguan për 15 min në 5000 rpm në 4 ° C dhe supernatuesit u mblodhën. Përqendrimet e proteinave u matën me një test BCA Protein Assay (#23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Blotting Western
Sasi të barabarta të proteinave (30 μg / korsi) u elektroforezuan në një xNUMX% polyacrylamide gel, pastaj transferoheshin në një membranë PVDF (Immun-Blot, 10 μm, Bio-Rad, MD, USA). Lidhja jo-specifike u bllokua duke preinkubuar membranën për 0.2 h në TBST (1 M NaCl, 0.5 mM Tris-HCl pH 20, 7.5% Tween-0.1) që përmban 20% BSA. Membrana u inkubua me antitrupin pan-FosB (3: 1) që u përdor më sipër për imunohistokimik, të tretur në TBST që përmban 1000% BSA. Pas larjes me TBST, membrana u inkubua me antitrupa IgG anti-lepuri konjuguar me HRP (3: 1 në TBST, NA5000, GE Healthcare, Buckinghamshire, Britani e Madhe) për 934 h në temperaturën e dhomës. Pas larjes me TBST, grupet e proteinave u vizualizuan përmes inkubacionit me Chemiluminescence Enhanced (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) dhe u kapën duke përdorur një Image Quant LAS 1 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, Mbretëria e Bashkuar). Membrana u riprovua më pas me antitrupin anti-gliceraldehid-4000-fosfat dehidrogjenazë (GAPDH) (#3, 2275: 1 në TBS-T, Trevigen, MD, USA) si një kontroll ngarkimi. Densiteti optik i grupeve të proteinave u quantifikua duke përdorur Image-J dhe normalizuar në nivelin e GAPDH.
4: Analiza statistikore
Ndryshimet në peshën e trupit të miut u analizuan me masa të përsëritura me dy drejtime ANOVA (grupi × kohë). Një t-test i palidhur është përdorur për të përcaktuar dallimet statistikore mes grupeve (Kontrolli vs. Runner). Analiza e korrelacionit të Pearson u përdor për të vërtetuar analizën e imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB (numërimi manual kundrejt matjes së imazhit) dhe për të shqyrtuar lidhjen ndërmjet nivelit të shprehjes FosB / ΔFosB dhe numrit të kalimeve DCX në DG. Të dhënat u prezantuan si mesatare ± SEM. Pragu për rëndësinë statistikore u vendos në P <0.05.
Rezultatet
1: Pesha e trupit dhe distanca e drejtimit në Eksperimentet 1 dhe 2
Ndryshimet në peshën e trupit të minjve të Kontrollit dhe Runner në Eksperimentet 1 dhe 2 janë grumbulluar dhe treguar në Figura 3. Masat e përsëritura të dyanshme ANOVA treguan një ndërveprim të rëndësishëm (grupi × kohë, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) dhe efekti kryesor i grupit F(1, 18) = 6.07, P <0.05), duke treguar një peshë trupore dukshëm më të ulët në minjtë Runner. Distanca e vrapimit për kafaz është treguar në Tabela 1. Megjithëse distanca e saktë e drejtimit të çdo miu ishte e pasigurt sepse minjtë ishin vendosur së bashku, vëzhgimi i rregullt konfirmoi se të gjithë minjtë shpesh kryenin drejtimin e rrotave. Mice Runner në Experiment 2 zgjatën më shumë se ato në Eksperimentin 1, por distanca mesatare e drejtimit (m / ditë / kafaz) ishte e qëndrueshme gjatë secilit eksperiment.
2: Vleresimi i FosB / ΔFosB quantifikimit te imunores ne perdorimin e vleresimit te imazhit
Ekzistonte një korelacion i rëndësishëm ndërmjet zonës FosB / ΔFosB-ir të marrë nga matja e imazhit dhe densiteti i bërthamave FosB / ΔFosB-ir të marra nga numërimi manual (r = 0.941, P <00001, Figura 4).
3: imunoreaktiviteti FosB / ΔFosB në hippocampus
Imazhet përfaqësuese të FosB / ΔFosB immunostaining në subfields dorsal dhe ventral hippocampal ishin treguar në Figura 5. Në të gjitha ROI të analizuara, imunoreaktiviteti i FosB / ΔFosB në minjtë Runner (Figura 5, djathtas) ishte cilësisht më i lartë se ai i minjve të kontrollit (Figura 5, qendra). Në minjtë Runner, analiza sasiore tregoi një rritje të konsiderueshme në zonën FosB / ΔFosB-ir në të dy dorsal (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) dhe nënfushat hipokampale ventrale (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figura 6).
4: imunoreaktiviteti FosB / ΔFosB në korteksin
Imazhet përfaqësuese të FosB / ΔFosB immunostaining në ROIs cortical janë paraqitur në Figura 7. Analiza sasiore zbuloi ndryshimet e varura nga regjioni në imunoreaktivitetin FosB / ΔFosB me afat të gjatë (Figura 8). Në minj Runner, zona FosB / ΔFosB-ir ishte dukshëm më e lartë në lëvore motorike (P <0.05) dhe korteksi i fuçisë somatosensore (P <0.05), por jo në korteksin vizual (P = 0.662) ose llambës së nuhatjes (P = 0.523). Në korteksin auditory, zona FosB / ΔFosB-ir prirur drejt një rritje në minj Runner (P =
5: Neurogjeneza
Imazhet përfaqësuese të immunostaining DCX janë paraqitur në Figura 9. Në hippocampus dorsal, imunoreaktiviteti DCX në minjtë Runner (Figura 9, djathtas) ishte cilësisht më i lartë në krahasim me kontrollin e minjve (Figura 9, majtas). Krahasuar me hippocampus dorsal, imunoreaktiviteti DCX në hippocampus ventral ishte i dobët në të dy minj Kontroll dhe Runner. Në minjtë Runner, numri i kalimeve ishte dukshëm më i lartë në dDGsp (P <0.01) dhe dDGip (P <0.01; Figura 10). Në hippocampus ventral, numri i kalimeve në minj Runner prirur të rritet, por nuk kishte dallime të konsiderueshme në mes të grupeve (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figura 10).
6: Korrelacioni midis shprehjes FosB / ΔFosB dhe neurogjenezës
U krye një analizë korrelacioni midis zonës FosB / ΔFosB-ir dhe numrit të kalimeve DCX (Figura 11). Për shkak se secili grup i të dhënave (p.sh. DGsp dorsal në miun kontrollues) përbëhet nga vetëm çifte 5, analiza u krye së pari me të gjitha çiftet 40. Në mënyrë intriguese, ekziston një korrelacion i rëndësishëm ndërmjet zonës FosB / ΔFosB-ir dhe numrit të kalimeve DCX (r = 0.885, P <0.0001). Përveç kësaj, një korrelacion i rëndësishëm u identifikua edhe kur DG dorsale (r = 0.762, P <0.05) dhe DG ventrale (r = 0.816, P <0.01) u analizuan veçmas.
7: Identifikimi i izoformës FosB / ΔFosB të nxitur nga funksionimi afatgjatë
Së fundi, për të identifikuar isoformën e fosB prodhimet e gjeneve të nxitura në hippocampus në përgjigje të drejtimit afatgjatë, hippocampi nga një grup shtesë i minjve iu nënshtruan blottingut perëndimor duke përdorur të njëjtin antitrup pan-FosB. Bende të shumëfishta të 35-37 kDa, që përfaqësojnë izoformat e modifikuara të ΔFosB [44], u rritën dukshëm në Runner kundrejt minjve të Kontrollit (Figura 12, P <0.01). Nga ana tjetër, izoforma 48 kDa FosB ishte e pazbulueshme në secilin grup. Një brez tjetër i dobët i dukshëm mbi 25 kDa ka të ngjarë të përfaqësojë izoformën Δ2ΔFosB (27 kDa). Kishte dy grupe të tjera, mbi 50 kDa dhe 37 kDa, të cilat ishin më shumë të ngjarë për shkak të lidhjes jo specifike. Kur përcaktohet sasia, nuk u gjetën dallime në këto grupe jo-ΔFosB midis grupeve (të dhënat nuk tregohen).
Diskutim
Në përmbledhje, ky studim së pari bëri një analizë imunohistokemike për të ekzaminuar 1) nëse drejtimi afatgjatë i rrotave vullnetare shkakton shprehjen FosB / ΔFosB në hippocampus; dhe 2) nëse ekziston një përgjigje specifike për rajonin përgjatë boshtit të saj dorso-ventral.
Katër javë të drejtimit të vullnetit të vullnetit nxorën një rritje të ndjeshme të imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB në të gjitha rajonet hipokampale të analizuara (p.sh., nënfushat e DG, CA1 dhe CA3 të dy pjesëve dorsale dhe ventrale të hipokampusit). Ne konfirmuam që 35-37kDa ΔFosB isoform ishte e rëndësishme fosB gjen gjeneruar në përgjigje të afatgjatë running. Këto rezultate mbështesin qartë hipotezën se ushtrimi afatgjatë i rregullt është një shkaktar i fuqishëm për induksionin ΔFosB në të gjithë hipokampusin dhe se induksioni i tij mund të jetë një mekanizëm i ri molekular me anë të të cilit stërvitja ndikon në lloje të ndryshme të funksioneve të varura nga hippocampus dorsal dhe / ose ventral.
1: Validimi dhe kufizimet e përcaktimit të sasisë së imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB duke përdorur kufizimin e imazhit
Një teknikë e matjes së imazhit, e përdorur gjerësisht në studimet imunohistokemike për numërimin e numrit të qelizave të synuara dhe për vlerësimin e morfologjisë së qelizës, u miratua në këtë studim për kuantifikimin specifik të rajonit të imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB [15,45,46]. U tregua një korrelacion i rëndësishëm midis niveleve të imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB me sasi të përcaktuar nga matja e imazhit dhe nga numërimi manualFigura 4) Sidoqoftë, për shkak se dendësia dhe mbivendosja parandaluan numërimin e numrit të bërthamave FosB / ΔFosB-ir në zona shumë të dendura, korrelacioni i demonstruar nënkupton vetëm saktësinë e metodës së pragut të figurës kur zonat FosB / ΔFosB-ir përfaqësojnë <~ 40% të totalit të ROI zonë Prandaj, kërkohet interpretim i kujdesshëm për zonat FosB / ΔFosB-ir> 40% të sipërfaqes totale të ROI.
Në veçanti, në DG të minjve të Runner (Figura 4), Shprehja FosB / ΔFosB u shkaktua shumë nga drejtimi i rrotave dhe shumica e bërthamave FosB / ΔFosB-ir u mbivendosën. Në këto zona, rritja e induksionit të shprehjes FosB / ΔFosB çon në një nënvlerësim më të madh të nivelit të shprehjes, pavarësisht nga metoda e vlerësimit të përdorur (matja e imazhit ose numërimi manual). Sidoqoftë, pavarësisht nga rreziku i nënvlerësimit, është e rëndësishme të theksohet se ky studim demonstroi me sukses rritje të konsiderueshme në zonën FosB / ΔFosB-ir në minjtë e DG të kontrabandës. Kjo sugjeron që kufizimet metodologjike nuk i komprometojnë gjetjet tona. Në vend të kësaj, nënvlerësimi i mundshëm rrit besueshmërinë e gjetjes që në afat të gjatë ka rritur imunoreaktivitetin FosB / ΔFosB në hippocampus.
2: Induksioni Uniform i ΔFosB brenda hippocampus duke funksionuar afatgjatë
Hippocampus ka gradients anatomike dhe funksionale përgjatë boshtit të saj gjatësor [26], kështu që për këtë studim imunoreaktiviteti FosB / ΔFosB në pjesët dorsale dhe ventrale të hipokampusit është analizuar veç e veç. Të dhënat treguan se shfaqja afatgjatë e FosB / ΔFosB në mënyrë uniforme në të gjitha ROI hippocampal të matura. Ky induksion uniform i imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB mund të jetë jo-specifikisht i shkaktuar nga ndryshimet sistemike metabolike të lidhura me afatgjatë. Megjithatë, është e rëndësishme të theksohet se ka pasur rritje specifike të rajonit të imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB në korteksin. Ky rezultat është mbështetur nga gjetjet e fundit që tregojnë se një periudhë akute e rutine për të drejtuar rrjedhjen e gjakut tronditës rajonal në rritje në hippocampus, por jo në llambën e nuhatjes [8]. Për më tepër, Rhodes et al. (2003) tregoi se ditët 7 të vullnetshme të drejtimit të drejtimit të rrotave të induksionuara të shprehjes c-Fos në DG dhe CA2 / 3 të hipokampusit (CA1 nuk ishte matur) dhe në korteksin shqisor, por jo në korteksin vizual [47]. Të marra së bashku, këto studime sugjerojnë që induksioni uniform të shprehjes së FosB / ΔFosB në hipokampus nuk është një pasojë jo specifike e drejtimit afatgjatë. Interesante, Hawley et al. kohët e fundit ka raportuar se stresi kronik i paparashikueshëm ka rritur shprehjen FosB / ΔFosB në dorsal, por jo në ventral, DG të hippocampus mibrës [48]. Me hetime të mëtejshme, modelet e dallueshme të induksionit FosB / ΔFosB siç janë ato të nxitura nga stërvitja ose stresi, do të ofrojnë njohuri të vazhdueshme në impaktet e varura nga stimuli në hipokampus.
Antitrupi primar pan-FosB i përdorur në këtë studim dihet të njohë të gjitha izoformat e proteinave FosB. Me analizën perëndimore blotting, ne kemi gjetur se vetëm isoforms që rritur në hippocampus pas running afatgjatë ishin isoformat e modifikuar të ΔFosB (35-37 kDa), e vetmja isoformë stabile midis proteinave të familjes Fos [11]. Ky konstatim është në përputhje me punën e mëparshme duke përdorur antitrupin pan-Fos për të demonstruar se 35-37 kDa ΔFosB është proteina familjare Fos mbizotëruese e nxitur në korteksin frontal nga stresi kronik [44]. Prandaj, rritja e imunoreaktivitetit Hippocampal FosB / ΔFosB e induktuar këtu nga afatgjatë, me shumë gjasa reflekton nivelin e ΔFosB.
Më pak është e njohur për efektet rajonale të ushtrimit në aspektet molekulare dhe strukturore të hipokampusit. Megjithatë, studimet e shumta të sjelljes tregojnë një potencial të madh për përmirësime të nxituara nga stërvitja në të dyja funksionet dorsale dhe ventrale të hippocampal. Ushtrimi është demonstruar për të përmirësuar mësimin hapësinor dhe kujtesën [34-38] dhe përpunimi hapësinor dhe kontekstual kryesisht varet nga hippocampus dorsal [27,28]. Në të kundërt, stërvitja dihet gjithashtu të ushtrojë vetitë anxiolytic dhe antidepressant [24,25,38] dhe këto përgjigje emocionale janë kryesisht të rregulluara nga hippocampus ventral [29,30]. Induksioni uniform i ΔFosB gjatë afatgjatë që shihet në këtë studim sugjeron që një formë e ndryshimeve neuroplastike ka ndodhur në të gjithë hipokampusin. Kjo do të shpjegonte pse stërvitja mund të ndikojë në funksione të varura nga hippocampus dorsal dhe ventral.
3: Analiza rajonale e neurogjenezës së stërngarkuar
Një dissociim funksional i neurogjenezës midis hippocampus dorsal dhe ventral është po ashtu duke marrë vëmendje në rritje [49]. Në këtë studim, duke përfituar nga karakteristikat morfologjike të neuroneve DCX-ir të papjekur [43], ne numëruam numrin e kryqëzimeve ndërmjet DCX-ir dendriteve dhe një segmenti të vijës së tërhequr përgjatë mesit të GCL. Kjo matje nuk siguroi numrin e përgjithshëm të neuroneve DCX-ir në DG, por mundësoi një sasi të saktë specifike për rajonin e nevojshëm për kryerjen e një analize të korrelacionit me të dhënat e shprehjes FosB / ΔFosB (shih më poshtë). Pas vrapimit afatgjatë, numri i neuroneve DCX-ir rritur ndjeshëm në dorsal, por jo në barkun, DG. Kjo sugjeron që stërvitja mund të stimulojë neurogjenezën më të habitshme në dorsal krahasuar me pjesën barkut të DG. Sidoqoftë, studimet e mëparshme kanë raportuar rezultate kontradiktore në të cilat drejtimi i rrotave ka rritur neurogjenezën si në DG dhe në barkun DG [50,51]. Në studimin e tanishëm, numri i kalimeve DCX-IR në DG-në e barkut priret të rritet me drejtimin, ndonëse madhësia e vogël e mostrës (minj 5 për grup) mund të ketë kufizuar aftësinë për të zbuluar një dallim të rëndësishëm statistikor ndërmjet grupeve. Prandaj, është e parakohshme që të përjashtohen nga mundësia që drejtimi vullnetar i rrotave të mund të stimulojë neurogjenezën hipokampale ventrale. Studime të mëtejshme të detajuara janë të nevojshme për të kuptuar specifikimin e rajonit të neurogjenezës së stërngarkuar në lidhje me procesin e saj të shumëfishtë (përhapja e qelizave, diferencimi, migrimi dhe mbijetesa).
4: Implikimet funksionale të induksionit ΔFosB të ushtruar nga stërvitja për rregullimin e plasticitetit hippocampal
Së fundmi, si hapi i parë në njohjen e implikimeve funksionale të induksionit ΔFosB të indukuar nga stërvitja në hipokampus, kemi ekzaminuar marrëdhënien e imunoreaktivitetit FosB / ΔFosB në kalimet DCX-ir në të dy DG-në dorsale dhe ventrale dhe gjetëm një korrelacion të rëndësishëm pozitiv mes dy variablat. Megjithëse mekanizmat e saktë me të cilët ΔFosB rregullon neurogjenezën e nxitur nga stërvitja mbeten të pasigurta, një studim i kohëve të fundit tregoi se fosBminj, pa FosB, ΔFosB, dhe Δ2ΔFosB (të gjitha fosB produkte), shfaqën defiçite në neurogjenezën bazale hippocampale, duke përfshirë përhapjen e qelizave progenitore neuronale, rritjen e migrimit ektopik të neuroneve të porsalindur dhe struktura jo normale të DG [20]. Megjithatë, këto ndryshime nuk u vërejtën fosB(d / d), të cilëve u mungon FosB, por jo ΔFosB / Δ2ΔFosB. Interesante, në fosB- minjtë e huaj, shprehje e disa gjeneve të lidhura me neurogjeneza, duke përfshirë VGF (Faktor i rritjes nervore VGF inducible) dhe vajzë (Prepropeptid Galanin) u redreguluan [20]. Meqë VGF dhe GAL janë molekula sekretore, një propozim që mban premtimin konsideron se neuronet që shprehin ΔFosB mund të rregullojnë neurogjenezën përmes aktivitetit autokrin / parakrin [20].
Përveç kësaj, duhet të theksohet se rajoni ku ΔFosB nxitet duke kryer mbivendosje hapësinore me rajonin ku aktiviteti neurogenik është i lartë. Ky zbulim sugjeron që neurogjeneza e nxitur nga stërvitja është në varësi të aktivitetit minimal. Aktivizimi neuronale është çelësi për ruajtjen dhe përmirësimin e funksionit të sistemit nervor qendror [9], përmes mekanizmave që përfshijnë shprehjen dhe çlirimin e faktorit neurotrofik të trurit (BDNF) [52,53], marrja e faktorit të rritjes së serumit të rritjes së serumit-1 (IGF-1) përmes barrierës së gjakut të trurit [54,55], shtypja e apoptozës [56], dhe rregullimin e lëvizshmërisë mitokondriale [57]. Prandaj, studimi i tanishëm sugjeron që stërvitja afatgjate shkaktoi aktivizimin e përsëritur të nervave, të dukshme në rritjen e shprehjes ΔFosB, e cila kontribuon në rritjen e plasticitetit hipokampal, potencialisht nëpërmjet këtyre mekanizmave të shumëfishta të përshkruara më sipër.
Ky studim vlerësoi vetëm neurogjenezën e nxitur nga stërvitja dhe lidhja e saj me shprehjen FosB / ΔFosB në DG. Sidoqoftë, imunoreaktiviteti i FosB / ΔFosB është induktuar gjithashtu në nënfushat CA1 dhe CA3. Ndërsa studimet e mëtejshme janë të nevojshme për të fituar më shumë kuptueshmëri të roleve funksionale të shprehjes ΔFosB të ushtruar nga stërvitja brenda këtyre nënfushave, literatura e mëparshme ofron një mundësi premtuese. Guan et al. (2011) tregoi se ablacioni specifik i ciklin-dependent kinazës 5 (Cdk5) në CA1 ose CA3 neuronet piramidale dëmtuan konsolidimin e kujtesës ose rikthim, respektivisht [58]. Interesante, Cdk5 është objektivi i valës së ΔFosB [59] dhe është i përfshirë në rregullimin e plasticitetit synaptik [60]. Prandaj, shprehja ΔFosB e nxitur nga stërvitja mund të përfshihet në rregullimin e plasticitetit synaptik përmes aktivizimit Cdk5 në nënfushat CA1 dhe CA3.
Përfundim
Ndërkohë që periudhat e ushtrimit akute ishin të njohura për të nxitur shprehjen e proteinave gjenetike të hershme të hershme në hippocampus, ky studim ofron provën e parë që ushtrimi i rregullt afatgjatë shkakton shprehje ΔFosB në të gjithë hipokampusin. thështë induksioni uniform i ΔFosB mbështet kuptimin e tanishëm se stërvitja është një intervenim efektiv jo-farmakologjik i aftë për të përmirësuar funksionet e shumta hipokampale. Së bashku me korrelacionin e dukshëm ndërmjet shprehjes FosB / ΔFosB dhe neurogenesis, këto të dhëna janë provokative dhe tregojnë një nevojë për studime të mëtejshme që përcaktojnë rolin e ΔFosB në ndërmjetësimin e efekteve të stërvitjes në funksionin hippocampal, duke përfshirë neurogjenezën.
Deklarata e Financimit
Referencat
;