J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Burim
Departamenti i Psikiatrisë, Qendra për Neuroscience Bazë, Universiteti i Texas Qendrës Mjekësore Jugperëndimore, Dallas, Texas 75390-9070, SHBA.
Abstrakt
Faktori i transkriptimit DeltaFosB (i quajtur edhe si FosB2 ose FosB [formë e shkurtër]) është një ndërmjetës i rëndësishëm i plasticitetit afatgjatë të shkaktuar nga truri nga ekspozimi kronik ndaj disa llojeve të stimujve psikoaktivë, duke përfshirë drogat e abuzimit, stresit dhe konfiskimeve elektrokonvuluese . Një veçori e veçantë e DeltaFosB është që, një herë e nxitur, ajo vazhdon në tru për periudha relativisht të gjata kohore në mungesë të stimulimit të mëtejshëm. Megjithatë, mekanizmat që e mbështesin këtë stabilitet të dukshëm kanë mbetur të panjohura. Këtu, ne demonstrojmë se DeltaFosB është një faktor relativisht i qëndrueshëm i transkriptimit, me një jetë gjysmë të përafërt të 10 h në kulturën qelizore. Për më tepër, ne tregojmë se DeltaFosB është një fosfoprotein në tru dhe se fosforilimi i një mbetje serine shumë të konservuar (Ser27) në DeltaFosB e mbron atë nga degradimi proteasomal. Ne japim disa linja të provave që sugjerojnë se kjo fosforilim është ndërmjetësuar nga kazeina kinaza 2. Këto gjetje përbëjnë provën e parë që DeltaFosB është fosforiluar dhe demonstron se fosforilimi kontribuon në stabilitetin e saj, e cila është thelbi i aftësisë së saj për të ndërmjetësuar përshtatjet afatgjata në tru.
Prezantimi
Faktori i transkriptimit ΔFosB, i quajtur edhe FosB2 ose FosB [formë e shkurtër], është një variant i lidhjes së prerë të C të gjenit të hershëm të hershëm fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu dhe Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Ashtu si FosB me gjatësi të plotë, ΔFosB ka një domain bazë të lidhjes së ADN-së dhe një zinxhir leucine përmes të cilit dimerizon me proteinat e Junit për të formuar komplekse të faktorit të transkriptimit të proteinave 1 (AP-1), të cilat rregullojnë shprehjen e shumë gjeneve (Morgan dhe Curran, 1995; Rylski dhe Kaczmarek, 2004). Pavarësisht nga mungesa e një pjese të domain-it të transaktivimit që gjendet në terminin C të FosB, ΔFosB funksionon si një aktivator i fuqishëm transkripsion dhe represor në qelizat e kultivuara dhe në tru (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu dhe Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung dhe Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔFosB nxitet në nivele të larta në një mënyrë specifike për rajonin në trurin pas ekspozimit kronik, por jo akut, ndaj një sërë stimulimesh psikoaktive, duke përfshirë stresin, lezionet e caktuara, medikamentet antipsikotike dhe antidepresive, drogat e abuzimit dhe shpërblimet natyrore (Hope et al., 1994b; Hiroi dhe Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Induksioni i ΔFosB ka qenë i lidhur drejtpërdrejt me efektet funksionale të disa prej këtyre stimujve në tru. Parrezikshmëria e ΔFosB edhe në mungesë të stimulimit shtesë e dallon atë nga të gjithë faktorët e tjerë të transkriptimit të familjes Fos, të cilat nxiten shpejt në përgjigje të stimujve akutë, prishen përsëri në nivele bazale brenda pak orësh dhe në përgjithësi tregojnë desensitizim pas stimulimit kronik (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi dhe Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Kjo e bën ΔFosB një kandidat tërheqës për të ndërmjetësuar disa nga ndryshimet afatgjata në shprehjen e gjeneve që qëndrojnë në bazë të përshtatjeve të qëndrueshme neuronale të shkaktuara nga disa stimulime kronike.
Meqenëse prania e zgjatur e ΔFosB ndodh në mungesë të induksionit të mëtejshëm të ARNi-së së saj (Chen et al., 1995), ne spekuluar se, ndryshe nga full-length FosB dhe të gjitha proteinat e tjera të familjes Fos, të cilat janë në thelb të paqëndrueshme, ΔFosB mund të jetë një faktor transkriptimi jashtëzakonisht i qëndrueshëm (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Për më tepër, analiza immunoblotting e indeve të trurit stimuluar kronike-kundrejt kronike sugjeroi që ΔFosB ndërrime në të dukshme Mr (masë molekulare) nga ~33 kDa në gjendje akute ndaj ~35-37 kDa gjatë trajtimit kronik (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Për shkak se nuk ka dëshmi për ekzistencën e ARNi shtesë që mund të kodojnë për këto izoforma të ndryshme, ne spekulojmë më tej se ΔFosB modifikohet posttranslationalisht dhe që ndoshta kjo kontribuon në stabilitetin e saj të pazakontë. Deri më sot, nuk janë raportuar analiza biokimike të qarkullimit apo modifikimeve posttranslazionale të ΔFosB. Qëllimi i këtij studimi ishte për të përcaktuar nëse ΔFosB është një fosfoprotein dhe nëse fosforilimi luan një rol në stabilitetin e tij.
Seksioni i mëparshëmSeksioni tjetër
Materialet dhe Metodat
Linjat qelizore të gjitarëve dhe konstruktet e ADN-së.
Qelizat PC12 (Clontech, Mountainview, CA) u kultivuan në glutamine me glukozë të lartë që përmbajnë L-glutamine (L-Gln) dhe u plotësua me serum 5% fetal të gjedhit (FBS), serum 10% kali (të dy nga Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicilinë dhe 100 μg / ml streptomicin (të dy nga Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Qelizat HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) u kultivuan në DMEM të lartë glukozë që përmbajnë L-Gln dhe u plotësuan me 10% FBS, penicilinë dhe streptomicinë. Të dy linjat qelizore u mbajtën në 37 ° C në një 5% CO të lagur2 Atmosferë.
Për transfeksionet e përkohshme me ADN, qelizat PC12 ose HeLa u mbillen në pllaka me gjashtë puse (të veshura me kolagjen I për qelizat PC12) në mënyrë që të arrijnë ngjitjen 90-100% ditën e ardhshme dhe pastaj u transfektuan duke përdorur Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Në disa eksperimente (shih Fiq. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB është shprehur kalimisht në qelizat PC12 nëpërmjet infeksionit me virusin herpes simplex (HSV).
ΔFosB dhe FosB cDNAs u morën nga konstruktet tona pTetop (Chen et al., 1997), dhe nënklonizuar në një vektor pcDNA3.1 (Invitrogen). Këto konstruksione pcDNA3.1-ΔFosB / FosB janë përdorur për shprehje në qelizat e gjitarëve dhe si një template për mutagenezën e drejtuar në vend. Rekombinant HSV-ΔFosB është përgatitur siç është përshkruar më parë (Neve et al., 1997), dhe përgatitja kishte një titër të ~1 × 108 Npf / ml.
Eksperimentet me impulse.
Përafërsisht 24 h pas infeksionit / transfektimit, qelizat (PC12 ose HeLa) në pllakat me gjashtë pllaka u lanë dy deri tre herë me 2 ml të PBS dhe inkuboheshin në 37 ° C për ~ 1 h në 2 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) plotësohet me 5% dializuar FBS (Hyclone, Logan, UT) për të zbrazur pishina intracellulare të Met dhe Cys. Në fund të kësaj periudhe "urie", drogat (nëse qelizat duhej të trajtoheshin) u shtuan dhe qelizat u etiketuan (pulsin) me 12-25 μCi të 35S Përbërja e etiketimit të proteinave (PERKINELMER, Wellesley, MA) për ~ 1 h në 37 ° C për të etiketuar të gjitha proteinat e reja të sintetizuara. Radiolabeli u hoq pastaj nga larja e qelizave dy deri në tre herë me 2 ml të PBS, dhe 35Proteinat e etiketuara me S janë ndjekur (ndjekje) duke zëvendësuar mediumin me një medium të "ftohtë" (joradioaktive) të plotësuar me 5% FBS dhe korrje të qelizave në pika të ndryshme kohore. Trajtimet e qelizave u ruajtën gjatë ndjekjes. Të gjitha shifrat e këtyre eksperimenteve tregojnë sasi të ngjashme fillestare të proteinave të ndryshme për të optimizuar krahasimet e shkallëve të qarkullimit të tyre.
Kafshët dhe trajtimi kronik i elektrokonvulsionit.
Shtazët e rritur të Sprague Dawley (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) u trajtuan një herë në ditë me konfiskime elektrokonvulsuese (ECS) për 7-9 d. ECS është kryer siç është përshkruar më parë (Hope et al., 1994a) duke përdorur një Ugo Basile (Comerio VA, Itali) Njësia ECS me cilësimet e mëposhtme: frekuenca, impulse 100 / s; impuls me, 0.5 ms; kohëzgjatja e goditjes, 1.0 s; dhe aktuale, 75 mA. Kafshët e kontrollit sham janë trajtuar paralelisht duke zbatuar elektrodat e veshit-clip pa ndonjë rrymë elektrike.
32 Etiketimi metabolik P.
Për etiketimin e fetëve të trurit, minjtë u kryqëzuan, truri u zbulua shpejt, dhe feta cortical frontale 300 μm u përgatitën me një microslicer DSK (Ted Pella, Redding, CA). Fletët u inkubuan brenda tubave plastikë në 2 ml të CSF artificiale të mangëta me fosfat (ACSF) dhe mbaheshin në 30 ° C nën bubullim konstant të butë me një O2/ CO2 përzierje (Hemmings et al., 1989). Fletët (dy feta për tub) u etiketuan me 1.3 mCi për 8-10 h në prani ose mungesë të acidit okadaic (100 ng / ml). Në fund të kësaj inkubimi, feta u shpënuan të paktën tre herë me ACSF të ftohtë dhe pastaj u homogjenizuan me sonication në 250 μl të tamponit të ftohtë të radioimunopresitimit (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (w / v) deoksikolat natriumi, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] plotësohet para përdorimit me SDS deri në 0.6%; koktej frenues të proteazës për qelizat e gjitarëve (përdoret në 5 μl / ml; (Përdoret në 1: 100, Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF dhe 2% glicerinë. Homogjenet pastaj u zien për 15 min dhe u pastruan me centrifugim në 15,000 × g për 15 min. Përqendrimi i proteinave në supernatuesit rezultues është vlerësuar duke përdorur analizën e proteinës BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Për 32P etiketimi i qelizave të kultivuara, pas infeksionit / transfektimit, qelizat u lanë dy deri tre herë me medium pa fosfat dhe inkuboheshin në këtë medium për ~ 24 h. Pas kësaj periudhe urie, 1-0.2 mCi e 32PH3PO4 (PERKINELMER) janë shtuar në çdo pus, dhe qelizat janë etiketuar për 4-12 h në varësi të llojit të eksperimentit (shih figurat 1-7 për specifikimet). Qelizat pastaj u lahen tri herë me PBS dhe lizuan në akull për 15 min me 50 μl të tamponit RIPA të plotësuar. Lysatët u mblodhën me scraping dhe u kaluan 10 herë përmes një gjilpërë 25 ga për të qethur ADN, zier për 10 min, dhe centrifuguar në 15,000 rpm për 15-30 min në 4 ° C. Lysatet e pastruar (supernatantet) u transferuan në një tub të ri dhe u krye një analizë e proteinës BCA (Pierce). Të gjitha shifrat e këtyre eksperimenteve tregojnë sasi të ngjashme të proteinave totale të tipit të egër (WT) dhe S27A ΔFosB për të optimizuar krahasimet e niveleve relative të fosforilimit.
Kimikatet dhe trajtimet e kulturës së qelizës.
Acid okadaik (OA, Sigma-Aldrich) u tret në etanol dhe përdoret në një përqendrim final të 100 ng / ml. 5,6-Diklor-1-β-d-ribofuranozil-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) u tretur në dimetil sulfoksid (DMSO; Sigma-Aldrich) dhe u përdor në kulturë qelizore në një përqendrim final të 50 μm. Spermina (Sigma-Aldrich) u tret në ujë dhe përdoret në një përqendrim final të 200 μm. Calphostin-C (Biomol) u shpërnda në DMSO dhe u përdor në 0.2 μm, ndërsa forumi 12-myristate 13-acetate (PMA, Promega, Madison, WI) u shpërnda në DMSO dhe përdoret në 0.1 μm. Peptidi inhibitor (m-AIP, Biomol) i autokamtidit-myristoiluar-2 u shpërnda në ujë dhe përdoret në një përqendrim final të 1 dhe 10 μm. Frenuesit e proteinave të gjërë të proteinave H-7 dhe H-8 (Biomol) u tretën në ujë dhe përdoreshin në një përqendrim final të 150 dhe 200 μm, respektivisht. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) dhe epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) u shpërndanë të dy në DMSO dhe u përdorën në një përqendrim final të 12.5 dhe 7.5 μm, respektivisht. Në të gjitha eksperimentet, DMSO (automjeti) iu shtua qelizave si të nevojshme për të mbajtur një sasi konstante të DMSO nëpër trajtime. për 32P, barnat janë shtuar menjëherë para emërtimit dhe mbahen për pjesën e mbetur të periudhës së etiketimit. Për eksperimentet me impulse, droga u shtua në kohën e "urisë" të Cys / Met, i mbajtur gjatë periudhës së etiketimit dhe më pas u shtua përsëri në mesazhin e ndjekjes. Frenuesit e proteasomës ishin të mprehur çdo 3-4 h përgjatë ndjekjes për të kompensuar qarkullimin e shpejtë të këtyre peptideve.
Imunopresitimi ΔFosB, imunoblotimi dhe autoradiografia.
Për immunoprecipitations, lysates janë holluar 1: 5 me RIPA thjeshtë për të sjellë përqendrimin SDS deri në 0.1% përpara se të vazhdojë me imunoprecipitim (IP). Për të kufizuar lidhjen jo specifike, lizatet u pastruan së pari nga imunoprecipitimi me joimmune IgG dhe protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) për të paktën 4 h. ΔFosB pastaj u imunoprecipitua nga lizatet e pastruara duke përdorur një antitrup poliklonal të dhisë që njeh një epitop të brendshëm të pranishëm në FosB dhe ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) në 0.5-1 μg IgG për 10 μg të proteinës lizate (50-300 μg e proteinave totale) në një vëllim total prej 0.5 ml. IPs u përzier butësisht në 4 ° C në një rotor për të paktën 8 h dhe pastaj 15 μl të proteinave G-Sepharose u shtua dhe IPs u përzier për të paktën një tjetër 4 h. IPs u pelleted nga tjerrje në 3000 × g për 3-5 min në 4 ° C, larë tre herë me 0.5 ml të rripit të ftohtë RIPA dhe dy herë me PBS të ftohtë që përmban 0.1% Tween 20. IP-të u resuspenduan pastaj në 0.5 ml të PBS të ftohtë, të transferuar, pelleted në një tub të ri dhe proteinat imunoprecipituar u elituan më pas me shtimin e 15-25 μl të 2 × reduktimit të tamponit të mostrës proteina Laemmli. Ky protokoll IP rezultoi në reshjet specifike dhe efektive të pothuajse të gjitha të ΔFosB në lysate. Proteinat imunoprecipituar u nënshtruan SDS-PAGE duke ngarkuar tërë IP në një 12.5% Tris-HCl Criterion gel (Bio-Rad, Hercules, CA), dhe pastaj u transferua në PVDF ose nitrocelulozë. Pas transferimit, membrana u thate ajrit dhe 32P- dhe 35Brezat e proteinave S-rrezatuar u vunë re nga autoradiografia duke përdorur film autoradiografik Kodak (Rochester, NY), si dhe me fosforimimim duke përdorur një Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Gjithsej (unphosphorylated and phosphorylated) ΔFosB në lysates qelizore ose homogenates trurit është zbuluar nga immunoblotting ose të proteinës immunoprecipitated (duke përdorur të njëjtën membranë përdorur për të zbuluar 32Proteina të etiketuara me P) ose me sasi të barabartë të proteinës lizate / homogjene të ekspozuar ndaj SDS-PAGE dhe të transferuara në PVDF ose nitrocelulozë. Membrana u bllokua fillimisht duke e inkubuar atë me 1% (w / v) qumësht të thatë të thatë (Bio-Rad) në PBS plotësohet me 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) për 1 h në 25 ° C. Membrana u imbujtua pastaj brenda natës në 4 ° C me antitrupin poliklonal anti-FosB të lepujve të gjeneruara kundër aminoacideve 1-16 të FosB / ΔFosB (përdoret në 1: 10,000). Pas inkubacionit primar, membranat u lanë katër herë për 5 min me tampon bllokues dhe pastaj inkuboheshin në 25 ° C për ~ 1 h me një IgG anti-lepuri të dhisë konjuguar me peroksidazën e rrikë (përdoret në 1: 5000 në bllokun e bustit, nga Vector Laboratorët, Burlingame, CA). Pastaj membranat u lanë tre herë për 10 min me tampon bllokues dhe një herë për 5 min me PBS. Gjithsej bandat e proteinave ΔFosB u vizualuan në film Kodak MR me anë të kemiluminescencës së zgjeruar (Pierce) dhe / ose përmes zbulimit të ndriçimit fluoreshent duke përdorur reagentët ECL-Plus (Amersham Biosciences) dhe Storm PhosphorImager.
Shpërndarja e tepërt dhe pastrimi i ΔFosB rekombinant nga qelizat e insekteve.
ΔFosB ishte mbiekspressuar në qelizat e insekteve Sf9 si një protein N-His (6) ΔFosB (N-His (2) ΔFosB) duke përdorur sistemin e shprehjes Bacac-to Bac Baculovirus (Invitrogen) dhe duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. Shkurtimisht, cDNA ΔFosB (mbetjet 237-1) e paraprirë nga N-terminal afiniteti MGHHHHHHAG u nënklonizuar në vektorin pFASTBacTM9, i cili u përdor për gjenerimin e baculovirusit rekombinant. Qelizat Sf6 u infektuan me virusin rekombinant dhe N-His (XNUMX) ΔFosB u pastrua nga lizat qelizore nga disa hapa kromatografik duke perfshire kromatografine e afinitetit duke perdorur nje kolone nikeli (Qiagen, Valencia, CA), shkembim anioni duke perdorur nje kolone mono-Q (Amersham Biosciences), dhe përjashtimi i madhësisë duke përdorur një kolonë të filtrimit me xhel (Amersham Biosciences).
In vitro studimet e fosforilimit.
In vitro Reaksionet e fosforilimit për kursin e kohës dhe analizat e stoikiometrisë u kryen në një vëllim të substancës 30 μm (N-His (10) ΔFosB ose substratit pozitiv të kontrollit), 6 μm ATP dhe 250 μCi / μl [γ-32P] ATP, tampon i furnizuar nga prodhuesi i kinazës dhe një nga kinazet e mëposhtme: CK2 (20 ng / μl, Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl, Upstate), PKC (1.6 ng / Calbiochem) ose p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Reaksionet e kursit të kohës u kryen duke hequr aliquote 5 μl nga solucioni i reagimit në pikat e caktuara kohore dhe duke shtuar një vëllim të barabartë të 4 × reduktimit të tamponit të mostrës proteina Laemmli. Parametrat kinetik Michaelis-Menten për reaksionin CK2 u përcaktuan në kushtet e qëndrueshme lineare të qëndrueshme të përcaktuara empirikisht. Këto reaksione janë kryer për 15 min në një vëllim 10 μl që përmban 2 ng / μl enzimë, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP dhe N-His (6) ΔFosB duke filluar nga 2.5-30 μm. Të gjitha reaksionet janë kryer në 30 ° C në një banjë uji. Pas SDS-PAGE dhe ngjyrosja e xhelit me Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), xhel u tha, dhe 32Inkorporimi i P-fosfatit u vlerësua nga analiza e fosforimit (shih më poshtë, Përcaktimi i të dhënave, llogaritjet dhe statistikat).
Hartë fosfopeptide dy-dimensionale dhe analiza fosfoamino-acid.
Të dy këto analiza janë kryer siç përshkruhet nga Ploegh dhe Dunn (2000). Shkurtimisht, fragmente të xhelit të thatë që përmbajnë 32P-etiketuar ΔFosB (ose nga vitro reaksione ose nga imunoprecipitatet e qelizave të etiketuara metabolikisht), u excizuan, rehidratuan, lanë dhe u nënshtruan tretjes tryptike. Supernatanti që përmbante produktet e tretjes tryptike u lyofilizua dhe liofilati laroi disa herë dhe resuspendohej në 10 μl të tamponit të elektroforetës, pH 1.9. Mostra (3 μl) është parë në një pllakë të kromatografisë së hollë me celulozë (TLC) (Analtech, Newark, DE) dhe është ndarë në një dimension me elektroforezë dhe dimensionin tjetër duke u ngjitur në TLC. Hartat rezultuese të fosfopeptidit u vizualizuan me autoradiografi dhe fosforimimim. Për analizën e acidit fosfoamino, 2 μl e tretjes tryptike që ishte ri-suspenduar në tampon elektroforezë u ndanë më tej me hidrolizë HCl në 105 ° C për 25 min në 3 m HCl nën një N2 Atmosferë. Reaksioni u ndalua nga një hollim gjashtëfish në ujë, dhe uji u liofilizua. Liofilati u resuspendua në 5 μl të tamponit të elektroforetës, pH 1.9, dhe u gjetën në një pllakë TLC të celulozës së bashku me standardet fosfo-Ser, -Thr dhe -Tyr. Elektroforeza u krye mbi gjysmën e gjatësisë së pllakës TLC duke përdorur tampon elektroforesh, pH 1.9, dhe pastaj pllaka u transferua në tampon pH 3.5 dhe elektroforeza u krye deri në përfundim. Standardet e acidit fosfoamino u vizualizuan duke spërkatur pjatën e TLC me një zgjidhje 1 (v / v) ninhidrin në aceton, dhe 32Mostrat e aminoacideve të emërtuara me P janë vizualizuar nga autoradiografia dhe nga fosforimimi.
siRNA-induced CK2α trokitje-poshtë.
Ne kemi përdorur një metodë ndërhyrje ARN për të hedhur poshtë në mënyrë selektive nivelet e CK2 (Di Maira et al., 2005). Qelizat PC12 u mbillen në pllaka me gjashtë puse të veshura me kolagjen I, për të arritur konfluencën ~ 70-80% të ditës së ardhshme, kur ato transfektoheshin transitorisht me 20 nm (përqendrimi përfundimtar) i të dyja syrineve që nuk targetonin ose siRNA të drejtuara drejt ARNi i katalitikës nën-njësi të Rat CK2, duke përdorur 5 μl të agjentit të transfektimit SilentFectin (Bio-Rad) dhe duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. Përafërsisht 24 h më vonë, qelizat transfektuan tranzicionalisht me plazmid ΔFosB, siç u tha më lart. Përafërsisht 24 h më vonë (~ 48 h pas transfeksionit siRNA), qelizat iu nënshtruan ose 32P etiketimin metabolik ose analizën impuls-ndjekje siç përshkruhet më sipër. Katër similet CK2α siRNA u përdorën me rezultate të ngjashme: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Si një kontroll negativ, ne përdorëm skapamento kontroll negativ #3 siRNA nga Ambion (Austin, TX). Shtrirja e CK2 knock-down u monitorua nga immunoblotting duke përdorur një antitrup poliklonale anti-CK2 (katalog # 06-873 nga Upstate) brenda një nate me një 1: 1000 hollim. β-Tubulin është përdorur si një kontroll ngarkimi dhe është zbuluar me një antitrup monoklonal (katalog # 05-661 nga Upstate) brenda një nate me një 1: 20,000 hollim.
Mangjeneza e drejtuar nga site-i.
Mutaimi i Ser27 në Ala ose në Asp është kryer duke përdorur një Kit Quick Change Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA) dhe duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. Për të futur mutacione Ser27 në proteina ΔFosB të miut, u përdorën primerët e mëposhtëm të mutagjenezës. Ser27 në Ala: (primer i kundërt) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 për Asp (primer përpara) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Bazat e mutuara janë të gërmuara dhe kodoni Ser27 është i kursyer.
Bioinformatics.
Vendet potenciale të fosforilimit dhe kinazat për ΔFosB u kontrolluan duke dorëzuar sekuencën e proteinave të miut në bazat e të dhënave të specializuara duke përfshirë ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), dhe NetPhosK (Blom et al., 2004).
Përcaktimi i të dhënave, llogaritjet dhe statistikat.
Sasia e proteinave të pranishme në membranën PVDF ose nitroceluloze u quantifikua duke përdorur një Storm PhosphorImager dhe software shoqërues ImageQuant (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Në kulturën e qelizës dhe fetë e trurit studimet e fosforilimit, vlerat e marra për 32Proteina me etiketën P u ndanë më pas me vlerat e fituara për totalin ΔFosB dhe u shprehën si raport. Në vitro studimet e fosforilimit, shuma e 32P-etiketuar ΔFosB për mol të ΔFosB (stoichiometry) është llogaritur siç përshkruhet më parë (Sahin et al., 2004). Të gjitha matjet janë marrë brenda gamës së linearit të instrumentit të përdorur. Parametrat kinetikë u llogaritën duke përdorur modelin Michaelis-Menten, ku V = VMax[S] / ([S]+KM), dhe VMax = k2[ETotal]. Gjysma e jetës (t1/2) të ΔFosB dhe FosB u vlerësuan nga komplotet impuls-ndjekje (duke përdorur regresionin jolinear që përshtaten më mirë pikat e të dhënave) dhe korrespondojnë me kohën në të cilën sasia e proteinës së mbetur është 50% e origjinës. Në të gjitha shifrat, rezultatet e paraqitura përfaqësojnë të paktën dy deri në tre eksperimente të pavarura. Në të gjithë grafikët, të dhënat e treguara janë mesataret ± SEM (3 ≤ n ≤16). Domethënia statistikore e dallimeve u vlerësua duke përdorur një unpaired t provë, korrigjuar për krahasime të shumëfishta dhe tregojnë yjet p ≤ 0.05.
Seksioni i mëparshëmSeksioni tjetër
Rezultatet
ΔFosB është një faktor jashtëzakonisht i qëndrueshëm i transkriptimit
Megjithëse kemi spekuluar më parë se ΔFosB është një faktor relativisht i qëndrueshëm i transkriptimit (Nestler et al., 2001), nuk është bërë ende një analizë e drejtpërdrejtë e profilit të qarkullimit të proteinës. Për të adresuar këtë pyetje, ne kemi kryer eksperimente me ndjekje impulsesh duke përdorur qelizat PC12, të cilat janë përdorur gjerësisht si një linjë e qelizave si neuron, në të cilën ΔFosB është shfaqur në mënyrë tranziente përmes infeksionit me një virus rekombinant herpes simplex (HSV-ΔFosB). Proteinat e reja të sintetizuara u etiketuan në mënyrë metabolike 35S-Met / Cys, dhe modeli i degradimit të 35S-etiketuar ΔFosB (35S-ΔFosB) është monitoruar duke imunoprecipituar atë nga lizatet e qelizave të marra në pika të ndryshme kohore pas heqjes së aminoacideve të rrezatuar. Analiza e imunoprecipitates nga SDS-PAGE dhe autoradiografia zbuloi se gjysma e jetës së ΔFosB në qelizat PC12 është ~ 10 h (Fig 1). Këto rezultate tregojnë se gjysma e jetës së ΔFosB është më e lartë se ajo e shumicës së faktorëve të transkriptimit (shih diskutimin), duke përfshirë FosB të plotë, gjysma e jetës së të cilës në kulturë qelizore është raportuar të jetë ~90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Veç kësaj, vlen të përmendet se degradimi i ΔFosB nuk përshtatet me një kurbë të prishjes eksponenciale të shkallës së parë, por është dyfazë, duke filluar nga një shkallë më e ngadalshme e degradimit. Kjo sugjeron ekzistencën e më shumë se një specie ΔFosB dhe / ose më shumë se një rrugë të degradimit.
Shiko versionin më të madh:
Figura 1.
ΔFosB është një faktor jashtëzakonisht i qëndrueshëm i transkriptimit. Gjysma e jetës së ΔFosB është ~ 10 h në kulturë qelizore. ΔFosB u shpreh në qelizat PC12 ose nga infeksioni me HSV-ΔFosB ose transfekcioni i përkohshëm me plazmidë që përmbajnë ΔFosB dhe qelizat iu nënshtruan eksperimenteve me impulse-ndjekje siç përshkruhet në Materialet dhe Metodat. Rezultatet ekuivalente u morën pavarësisht nga metoda e përdorur për të mbivlerësuar ΔFosB. Shifra tregon kursin e kohës (dhe autoradiogram përfaqësues) të degradimit ΔFosB. Të dhënat e komplotuara janë mesatarja ± SEM e të paktën pikave të të dhënave individuale të 15 të marra nga të paktën pesë eksperimente të pavarura. Për krahasim, tregohet gjysma e jetëgjatësisë së raportit FosB me gjatësi të plotë.
ΔFosB është një fosfoprotein në tru
Ne kemi hipotizuar se modifikimi post-translacional i ΔFosB mund të kontribuojë në stabilitetin e saj të dukshëm. Për shkak se fosforilimi ka treguar të modulojë aktivitetin e faktorëve të transkriptimit në shumë mënyra, duke përfshirë stabilitetin e tyre (për rishikim, shih Desterro et al., 2000; Whitmarsh dhe Davis, 2000), ne hetuam nëse ΔFosB është një fosfoprotein. Për këtë qëllim, shprehja ΔFosB u nxit në trurin e miut duke përdorur ECS kronik, një trajtim i njohur për të nxitur nivele të larta të ΔFosB, veçanërisht në korteksin frontal (Hope et al., 1994a). Një ditë pas trajtimit të fundit ECS, kur nivelet e ΔFosB mbeten të larta, janë përgatitur feta të holla hollale frontale dhe etiketohen në mënyrë metabolike me 32P-ortofosfate. Një grup paralel i feta nuk ishte i radiolabeluar dhe këto janë përdorur për të zbuluar nivelet totale të ΔFosB. Pas imunoprecipitimit me një antitrup të veçantë anti-FosB / ΔFosB dhe ndarja e proteinave imunoprecipituar nga SDS-PAGE, fosforiluar 32P-etiketuar ΔFosB u zbulua nga autoradiografia, ndërsa total ΔFosB u zbulua nga immunoblotting. Kjo analizë zbuloi se ΔFosB është fosforiluar në tru, siç dëshmohet nga një specifik 32P-etiketuar me barkë ~35 kDa e pranishme në mostrat e trurit të trajtuar kronikë, por është praktikisht e padeklarueshme në kontrollet e trajtuara me sham (Fig 2A). Kjo është në përputhje me faktin se, në mungesë të stimulimit kronik, nivelet bazë të ΔFosB janë shumë të ulëta. Specifikimi i reagimit të imunoprecipitimit është ilustruar nga mungesa e sinjalit në precipitatin joimmune IgG.
Shiko versionin më të madh:
Figura 2.
ΔFosB është një fosfoprotein në tru. A, ΔFosB është fosforiluar në tru. Endosgeni ΔFosB është induktuar në trurin e miut me trajtim kronik ECS siç përshkruhet në Materialet dhe Metodat. Feta frontale cortical u etiketuan në mënyrë metabolike 32PH3PO4 për disa orë. Pas homogjenizimit të fetave, ΔFosB u imunoprecipitua dhe fosforiloi ΔFosB (32P-ΔFosB) u zbulua nga autoradiografia (paneli i lartë). Gjithsej ΔFosB në imunoprecipitate joradioaktive u zbulua nga immunoblotting (panel fund). Si kontrolle negative, imunoprecipitati i një sham-trajtuar kafshë dhe nonimmune IgG janë treguar. B, Vendet e fosforilimit të kandidatëve dhe kinazat me rezultatet përkatëse të parashikimit për sekuencën e proteinës së miut ΔFosB u gjetën nga analiza bioinformatike. Vendet e kandidatëve me rezultatet më të larta të parashikimit theksohen në sekuencën e proteinave dhe renditen në tabelë. Domeni (themelor) i lidhur me ADN-në dhe zinxhirët e leucinës janë të theksuara në sekuencën e proteinave. C, D, Fosforilacioni ΔFosB rritet nga frenuesi Ser / Thr fosfataze OA. C, 32Nivelet P-ΔFosB në imunoprecipitate nga feta frontale cortical etiketuar në mungesë (Ctr) ose prania e 100 ng / ml OA (grafiku dhe paneli i lartë) u zbuluan me autoradiografi. Paneli i fundit tregon totalin ΔFosB të zbuluar në imunoprecipitate nga feta pa etiketime me imunoblotim. D, Qelizat PC12 u infektuan me HSV-ΔFosB ose HSV-LacZ (vektor) dhe etiketohen metabolikisht me 32PH3PO4 në mungesë (Ctr) ose prania e 100 ng / ml OA. 32Nivelet P-ΔFosB në imunoprecipitate u zbuluan me autoradiografi (grafik, panel i lartë). Paneli i fundit tregon totalin ΔFosB të zbuluar në lysate qelizore nga immunoblotting.
Si një hap i parë drejt sqarimit se cilat kinaze (s) dhe site (et) janë të përfshira në fosforilimin ΔFosB, ne kemi nënshtruar sekuencën e saj të aminoacideve në disa analiza bioinformatike. Kjo ka zbuluar se, edhe pse ΔFosB nuk përmban asnjë vend kandidatësh për fosforilizim të Tyr, ajo përmban disa vende konsensusi Ser / Thr kinazë, duke përfshirë tre zona CaMKII, tre vende CK2 dhe dy vende PKC me rezultate shumë të larta të parashikimit të fosforilimitFig 2B). Nëse, siç parashikohet nga bioinformatika, ΔFosB fosforilizohet vetëm në mbetjet Ser ose Thr, atëherë fosforilimi i saj duhet të jetë i moduluar në mënyrë të konsiderueshme nga aktiviteti i Ser / Thr fosfatazave. Për të provuar këtë hipotezë, ne etiketonim feta frontale cortical me 32P-ortofosfat në prani ose mungesë të OA, një inhibitor i fosfatazës proteinike Ser / Thr. Siç tregohet në Figura 2C, OA shkaktoi një rritje të madhe (~ 2.5-fish) 32P-ΔFosB. Ajo gjithashtu shkaktoi një rritje të vogël në nivelet totale të ΔFosB, i cili është në përputhje me raportet e mëparshme që lidhin efektet kancerogjene të OA ndaj aftësisë së saj për të nxitur disa gjene të hershme të hershme duke përfshirë proteinat Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Rezultati neto është një rritje e konsiderueshme e përgjithshme (~ 60%) në nivelet e fosforiluara të ΔFosB.
Ne pastaj hetojmë nëse, në qelizat PC12, të cilat janë më të përshtatshme ndaj manipulimit eksperimental, ΔFosB tregoi një model të fosforilimit të ngjashëm me atë të parë në tru. Ne shprehëm ΔFosB në qelizat PC12 nëpërmjet infeksionit me HSV-ΔFosB dhe etiketonin metabolikisht qelizat me 32P-ortofosfat në praninë ose mungesën e OA. Shprehja e suksesshme dhe imunoprecipitimi i proteinës nga qelizat e infektuara nga HSV-ΔFosB tregohet nga prania si në imunoblot (Fig 2D, paneli fundor) dhe autoradiografi (paneli i lartë) i një bande ~35 kDa, që mungon në qelizat e infektuara me vektor. Siç është vërejtur në tru, OA shkaktoi një rritje të vogël në nivelet totale të ΔFosB, por një rritje shumë më e lartë (rreth dyfish) në 32P-ΔFosB, duke rezultuar në një rritje të ndjeshme (~ 50%) në fosforilimin e ΔFosB. Për më tepër, në përputhje me parashikimet bioinformatike, trajtimi i qelizave PC12 me një inhibitor të fosfatazës Tyr nuk rezultoi me ndryshime të rëndësishme në 32P-ΔFosB nivelet (të dhënat nuk tregohen). Së bashku, këto zbulime zbuluan se ΔFosB fosforilizohet në mbetjet Ser dhe / ose Thr në trurin dhe në qelizat PC12 dhe konfirmoi që ky i fundit të jetë një sistem i mirë kulturor i qelizës në të cilën për të studiuar më tej profilet e fosforilimit dhe degradimit të ΔFosB.
CK2 por jo PKC ose CaMKII phosphorylates ΔFosB vitro
Siç u përshkrua më lart, analiza e sekuencës aminoacidike ΔFosB zbuloi rezultate të larta parashikimi për faqet e fosforilimit të CK2, PKC dhe CaMKII. Për të përcaktuar se cili prej këtyre kinazave mund të phosphorylate ΔFosB, kemi kryer një seri të vitro reaksionet e fosforilimit duke përdorur kinazat e pastruara dhe ΔFosB rekombinante të pastruar. Siç tregohet në Figura 3A, të tre kinazave kandidat, vetëm CK2 fosforilonte ΔFosB në një mënyrë të rëndësishme. Përveç kësaj, u testuan disa kinaza të tjerë (p.sh., GSK3 dhe p70S6K), por nuk arritën të phosphorylate dukshëm ΔFosB (të dhënat nuk tregohen). Karakterizim shtesë i reagimit CK2 sipas analizës së kursit kohor zbuloi se ky kinazë mund të katalizojë inkorporimin e ~0.5 mol të fosfatit për mol të ΔFosB (Fig 3B). Fakti që CK2 mund të fosforilojë ΔFosB vitro në një stoichiometry të konsiderueshme (~50%) është sugjeruese për një reagim fiziologjikisht të rëndësishëm. Ne pastaj studiuam kinetikën e kësaj reaksioni duke inkubuar CK2 në prani të sasive në rritje të ΔFosB të pastruar dhe kemi përcaktuar që CK2 fosforilon ΔFosB me një Vmax e 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 e enzimes, a KM e 18.4 μm, dhe a kmace e 0.2 / s (Fig 3C). Vlerat e marra për këto parametra kinetikë më tej mbështesin rëndësinë fiziologjike të kësaj reaksioni. Për shembull, KM e CK2 për DARPP32, një nga substratet më të njohura të saj, është 3.4 μm, dhe kmace është ~ 0.3 / s (Girault et al., 1989); KM për ATP shkon nga ~ 10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), dhe se për kazeinë varion nga ~ 10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Së bashku, këto të dhëna tregojnë se ΔFosB është një substancë bona fide për CK2 vitro.
Shiko versionin më të madh:
Figura 3.
CK2 por jo PKC ose CaMKII phosphorylates ΔFosB vitro. Autoradiografi (paneli i lartë) tregon produktin e fosforiluar dhe xhelja e ngjyrosur me Coomassie (paneli i poshtëm) tregon totalin ΔFosB të pranishëm në reaksion. A, Iu nënshtrua ΔFosB rekombinant i pastruar vitro fosforilimi nga kinaza të ndryshëm të kandidatëve (tre prej të cilave janë treguar). B, Kursi i kohës dhe analizat stoikiometrike tregojnë se CK2 mund të fosforilojë ΔFosB vitro me një stoichiometry of ~50%. C, Analiza kinetike e reagimit CK2 zbuloi se ΔFosB është një bona fide vitro substrate. Linearizimi i reagimit tregohet në një komplot dyfish reciprok (në fund), por parametrat kinetikë janë nxjerrë nga kurba Michaelis-Menten (lartë).
CK2 modulon fosforilimin dhe stabilitetin e ΔFosB në qelizat e paprekura
Për të vlerësuar relevancën fiziologjike të fosforilimit të ΔFosB të ndërmjetësuar nga CK2, kemi kryer hartën krahasuese të fosfopeptidit duke përdorur vitro fosforiluar dhe PC12-fosforiluar ΔFosB-qelizore. Pas SDS-PAGE dhe eluimit me xhel 32P-ΔFosB (nga vitro reagime ose nga imunoprecipitati i 32P-etiketuar qelizat), proteina u tretet me trypsin, dhe fosfopeptidet rezultuese iu nënshtruan ndarjes dy-dimensionale. Kjo analizë zbuloi se phosphopeptide kryesore nga reaksioni CK2 comigrated me një nga dy phosphopeptides të mëdha nga fosforilated ΔFosB në qelizat PC12 (Fig 4A), ndërsa fosfopeptidet që rezultojnë nga reagimi i PKC ose CaMKII (të dhëna nuk u shfaqën) nuk. Ekziston një fosopeptid i dytë ΔFosB i pranishëm në hartë nga qelizat PC12, por për shkak të pamundësisë së ndonjë prej kinazave që kemi testuar për të gjeneruar një fosfopeptid të ngjashëm vitro, ne aktualisht nuk e dimë nëse ky fosfopeptid i dytë përmban një vend të fosforilimit të ndryshëm nga fosfopeptidi tjetër ose nëse ai përfaqëson një peptid të veçantë triptoz që përmban të njëjtin vend të fosforilimit.
Shiko versionin më të madh:
Figura 4.
CK2 modulon fosforilimin dhe stabilitetin e ΔFosB në qelizat e paprekura. A, CK2 por jo PKC duket se fosforilon ΔFosB në qeliza. Harta fosfopeptide dy-dimensionale e fosforilimit të ΔFosB nga CK2 ose PKC vitro ose me qeliza të paprekura PC12. Shigjetat tregojne komigrimin e peptidit CK2-fosforiluar, por jo PKC-fosforiluar me nje nga phosphopeptides ΔFosB te marra nga qelizat PC12. B, Fosforilacioni ΔFosB në qelizat PC12 rritet duke trajtuar qelizat me sperminë aktive CK2 (SP) dhe ulet nga trajtimi me DRB të frenuesit CK2. Në të kundërt, phosphorylation ΔFosB në qelizat PC12 nuk u prek nga trajtimi me një aktivizues PKC (PMA) ose me inhibitorin e PKC të veçantë-calphostin-C (Calph). Janë treguar një autoradiogram përfaqësues (panel i lartë) dhe immunoblot (panel fund). C-F, Efekti i aktivitetit CK2 në stabilitetin ΔFosB. Shifrat tregojnë kursin e kohës (dhe autoradiogramin përfaqësues) të degradimit ΔFosB. Qelizat PC12 që shprehin në mënyrë të përkohshme ΔFosB u nënshtruan eksperimenteve të impulseve të kryera në mungesë ose praninë e DRB të inhibitorit CK2 (C), spermina e aktivatorit CK2 (D), ose frenuesi i spektrit të gjerë të kinazës H-8 (E), i cili u përdor për të kontrolluar për efektet jo-specifike të DRB. F, Efekti i goditjes së nënkushtit katalitik të CK2 në stabilitetin ΔFosB. Qelizat PC12 u transfektuan me ose siRNA të pakontrolluar (Ctr) ose siRNA që targetonin miun CK2α dhe 24 h më vonë të transfektuar me një plazmid ΔFosB. Paneli i sipërm përshkruan imunoblotet e lizatëve të tërë qelizave që tregojnë efektin e siRNA CK2 në nivelet e proteinave CK2 dhe ΔFosB. Immunoblot përkatës për β-tubulin paraqitet si një kontroll ngarkimi.
Për të adresuar më tej rëndësinë fiziologjike të CK2 si një ΔFosB kinase, ne trajtuam qelizat PC12 që shprehin ΔFosB me dy ilaçe që modulojnë aktivitetin CK2. Siç tregohet në Figura 4B, ΔFosB fosforilimi u zvogëlua me trajtimin e qelizave PC12 me inhibitorin CK2 të depërtueshëm qelizor DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) dhe u rrit me trajtimin me sperminën e poliaminës, e njohur si aktivizues i fuqishëm CK2 (Cochet dhe Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Në të kundërt, trajtimi i qelizave PC12 me inhibitorin PKC calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) ose aktivizuesi PKC PMA (Schmidt dhe Hecker, 1975; Beh et al., 1989) nuk rezultoi në ndryshime të rëndësishme në fosforilimin e fosforilimit. Në rastin e PMA, rritja e lehtë (dhe jo e rëndësishme) në 32P-ΔFosB mund të llogaritet nga një rritje në nivelet totale të ΔFosB të shkaktuara nga ky ilaç; në fakt, është raportuar se esteret e forbolit nxisin shprehjen e disa proteinave të familjes Fos, duke përfshirë FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Për më tepër, trajtimi i qelizave me inhibitorin specifik të qelizës-kapsulës CaMKII m-AIP (Ishida dhe Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) gjithashtu nuk rezultoi në fosforilimin e fosforilimit të fosforit ΔFosB (të dhënat nuk janë treguar). Së bashku, këto rezultate janë në përputhje me tonë vitro gjetjet dhe tregojnë se në qelizat e paprekura ΔFosB ka gjasa të phosphorylated nga CK2 por jo PKC ose CaMKII. Fakti që ndalimi i CK2 nuk e parandalon plotësisht fosforilimin e fosforilimit të fosforiluar tregon për ekzistencën e vendeve të tjera të fosforilimit në proteinë.
Ne pastaj shqyrtojmë nëse CK2 luan një rol në qarkullimin e ΔFosB dhe në këtë mënyrë në stabilitetin e tij. Për këtë qëllim, ne kryerim eksperimente impuls-ndjekje duke përdorur qelizat PC12 shprehur ΔFosB trajtuar ose me FK inhibitor CK2 ose aktivator CK2 përdorur në studimin phosphorylation. Siç tregohet në Figura 4C, trajtimi i qelizave me CK2 frenues DRB kishte një efekt të rëndësishëm në shkallën e qarkullimit të ΔFosB, të evidentuar nga ndryshimi në formën e kurbës së saj të degradimit, nga bifazhi në një kurbë që është më afër asaj të një kalbje eksponenciale. Në anën tjetër, prezenca e spermës së aktivatorit CK2 shkaktoi një ulje të ndjeshme të shkallës së degradimit të ΔFosB, gjë që çoi në akumulimin e proteinës gjatë orëve të para të ndjekjes (Fig 4D).
Siç është rasti me shumë aktivatorë dhe frenues të kinazës, spermina dhe DRB mund të kenë efekte metabolike jashtë modulimit të aktivitetit CK2. Në fakt, DRB ka treguar të pengojë faktorin e transkriptimit të kinazës së lidhur me faktorin IIH (TFIIH) (Yankulov et al., 1995), e cila rezulton në ndalimin e transkriptimit të ARN polymerase II. Meqë ky efekt mund të ndikonte në qëndrueshmërinë e ΔFosB, ne analizuam efektin e frenuesit të spektrit të gjerë të kinazës H-8 (Hidaka dhe Kobayashi, 1992) në qarkullimin ΔFosB në një përqendrim (200 μm) të njohur për të penguar TFIIH-lidhur kinase, por jo CK2 (Yankulov et al., 1995). Siç tregohet në Figura 4E, trajtimi me H-8 nuk ka ndikuar në normën e qarkullimit të ΔFosB. Rezultate të ngjashme u arritën me H-7, një tjetër frenues i spektrit të gjerë të kinazës, i përdorur në një përqendrim që pengon kinazën e lidhur me TFIIH, por jo CK2 (të dhënat nuk tregohen). Këto të dhëna mbështesin më tej interpretimin se reduktimi i stabilitetit ΔFosB të shkaktuar nga DRB ka të ngjarë që i atribuohet ndalimit të CK2.
Për të përcaktuar më tej rolin e CK2 në qarkullimin ΔFosB, ne hetuam pasojat e trokitur poshtë CK2 nëpërmjet siRNA. Ne kryerim këto eksperimente duke përdorur qelizat PC12 të cilat u transfektuan së pari me kontrollin (nontargeting) siRNA ose një siRNA që synon mRNA të nën-njësisë katalitike të miut CK2 (CK2α) dhe 24 h më vonë të transfektuar me ΔFosB. Siç tregohet në Figura 4F, transfekcioni me SIRNA CK2α në mënyrë efikase dhe në mënyrë specifike shkatërroi nivelet e proteinave CK2α pa ndikuar në nivelet e ΔFosB (paneli më i lartë). Analiza Pulse-ndjekje zbuloi se trokitje poshtë CK2 rezultoi në një rritje të konsiderueshme në normën e qarkullimit të ΔFosB siç dëshmohet nga degradimi më i shpejtë i proteinës. Fakti që frenimi i aktivitetit CK2 (qoftë përmes trajtimit DRB ose siRNA) rrit qarkullimin e ΔFosB dhe rezulton në zhdukjen e komponentit të ngadaltë të kurbës bifazike, ndërsa aktivizimi i CK2 rrit fazën e ngadaltë të kurbës, siguron mbështetje të fortë për ideja se CK2 luan një rol në rregullimin e stabilitetit të ΔFosB.
CK2 phosphorylates ΔFosB në Ser27
Për të filluar identifikimin e site (ëve) mbi ΔFosB fosforiluar nga CK2, kemi kryer analiza phospho-amino acid të phosphorylated fosforilated ΔFosB rekombinant nga CK2 vitro dhe ΔFosB fosforiluar në qelizat PC12. Këto eksperimente zbuluan se, në të dyja rastet, i vetmi fosfo-amino acid i zbuluar ishte fosfo-Ser (Fig 5A). Ky zbulim, së bashku me stoikiometrinë e marrë për CK2 vitro reagimi i fosforilimit (~50%) (Fig 3B) dhe praninë e vetëm një vendi të rëndësishëm në hartën phosphopeptide CK2 (Fig 4A), sugjeron që fosforilimi i CK2 i ΔFosB ndoshta është i kufizuar në një mbetje të vetme serine. Ky përfundim është në përputhje me analizën e faqes së konsensusit të fosforilimit (Fig 2B), i cili parashikoi vetëm një Serine kandidate, dmth, Ser27, për CK2. Analiza tatimore tregoi se Ser27 është shumë e konservuar nëpërmjet evolucionit në mesin e anëtarëve të familjes Fos (Fig 5B), duke sugjeruar se ajo mund të ketë një funksion të rëndësishëm fiziologjik.
Shiko versionin më të madh:
Figura 5.
CK2 Phosphorylates ΔFosB në Ser27. A, Analiza e fosforaminës CK2-fosforiluar (vitro) dhe PC12 qelizore-phosphorylated ΔFosB tregon se, ne te dyja rastet, fosforilimi i madh i mbetjeve eshte serine. B, Analiza ndër-specie e sekuencës aminoacidike FosB / ΔFosB zbuloi ruajtjen e lartë të Ser27 në mesin e anëtarëve të familjes Fos nga njeriu në peshk zebrafish (theks të errët). Megjithatë, mbetja acidike në pozicionin + 3, e cila kërkohet për vendndodhjen e konsensusit CK2, nuk është ruajtur (nxjerr në dritë). C, Qelizat HeLa u transfektuan transitorisht me ose ΔFosB (WT) ose ΔFosB të egra që përmbanin një mutacion pikë për të zëvendësuar Ser27 me Ala (S27A). Qelizat u etiketuan në mënyrë metabolike 32PH3PO4 dhe trajtohen me automjete ose me spermine (SP) për të aktivizuar CK2. Janë paraqitur autoradiogram përfaqësues (panel i lartë) dhe imunoblot (panel i poshtme) i imunoprecipitateve të fituara ΔFosB. Shfaqet imunoprecipitimi i qelizave të maskuara (vektor).
Për të përcaktuar nëse Ser27 është fosforiluar në ΔFosB, ne kemi ndryshuar këtë mbetje në Ala, dhe kemi analizuar pasojat në statusin e fosforilimit të proteinës. Për këtë qëllim, kemi përdorur qelizat HeLa (të cilat mund të transfektohen me efikasitet më të lartë) për të shprehur në mënyrë të përkohshme ose WT ose S27A mutant ΔFosB. Përafërsisht 24 h pas transfekcionit, qelizat u etiketuan në mënyrë metabolike 32P-ortofosfat dhe lizat e tërë qelizave u përgatitën. Pas immunoprescipitation dhe SDS-PAGE, 32P-ΔFosB u zbulua nga autoradiografia dhe total ΔFosB nga immunoblotting. Siç tregohet në Figura 5C (paneli fundor), ΔFosB nuk u zbulua në qelizat e transfektuara me vektor, ndërsa qelizat e transfektuara me WT ose S27A mutant ΔFosB shprehën me sukses proteinën. Ne kemi gjetur se mutacioni S27A shkaktoi një reduktim të konsiderueshëm (~30%) 32P-ΔFosB nivelet (Fig 5C, panel i lartë dhe grafik), duke treguar se në qelizat e gjalla, ΔFosB është fosforiluar në Ser27. Në një përpjekje për të përcaktuar nëse në qelizat Ser27 është me të vërtetë fosforiluar nga CK2, ne krahasuam aftësinë e spermës së aktivatorit CK2 për të moduluar fosforilimin e WT dhe S27A ΔFosB. Siç e kishim parë më herët në qelizat PC12 (Fig 4B), trajtimi i qelizave HeLa me sperminë në mënyrë të konsiderueshme u rrit fosforilimi i proteinës WT. Fakti që ky efekt u zvogëlua ndjeshëm nga mutacioni S27A (Fig 5C) mbështet interpretimin se Ser27 në ΔFosB është një substancë fiziologjike për CK2.
Fosforilizimi i Ser27 rregullon stabilitetin e ΔFosB
Duke vendosur që stabiliteti i ΔFosB është zvogëluar kur CK2 frenohet dhe rritet kur CK2 aktivizohet (Fig 4), dhe se CK2 fosforilon ΔFosB në Ser27 (Fig 5), ne parashikuam që parandalimi i fosforilimit të kësaj zone duhet të destabilizojë proteinën. Eksperimentet e ndjekjes me impulse të kryera me qelizat HeLa që shprehin rastësisht WT ose S27A mutant ΔFosB zbuluan se, siç parashikohej, mutacioni i S27A rezultoi në një rritje të ndjeshme të shkallës së degradimit të ΔFosB dhe një rënie shoqëruese në gjysmën e jetës së proteinës (Fig 6A). Ne pastaj hetojmë nëse ky mekanizëm rregullues po ashtu ndodh në linjën qelizore më të ngjashme me neuronet PC12. Këto eksperimente zbuluan se, siç e kishim vërejtur në qelizat HeLa, mutacioni i pikë S27A shkakton një rënie dramatike në gjysmën e jetës së ΔFosB në qelizat PC12 (nga ~11 në ~ 4 h) (Fig 6B). Fakti që kjo destabilizim është e ngjashme me atë të shkaktuar nga pengimi ose rrëzimi i CK2 (Fig 4) siguron mbështetje të mëtejshme për idenë që fosforilimi i Ser2 i ndërmjetësuar nga CK27 rregullon stabilitetin e ΔFosB. Dëshmia shtesë për rolin rregullator të fosforilimit të Ser27 në qarkullimin e proteinave ΔFosB është marrë duke përdorur një Sermosmusomat fosfomimetik të Asp mutation (S27D). Mutacioni i S27D konsiderohet fosfomatik, sepse vendos një grup të madh të ngarkuar negativisht (karboksil) në aminoacid 27 dhe në këtë mënyrë pjesërisht imiton fosforilimin e Ser27. Siç tregohet në Figura 6C, mutacioni S27D shkaktoi efektin e kundërt të mutacionit S27A dhe rezultoi në një proteinë dukshëm më të qëndrueshme se proteina WT. Ngjashëm me efektin e fituar pas aktivizimit CK2 (Fig 4D), mutacioni S27D rezultoi në akumulimin dhe kështu rriti nivelet e ΔFosB gjatë orëve të para të ndjekjes.
Shiko versionin më të madh:
Figura 6.
Fosforilizimi i Ser27 rregullon stabilitetin e ΔFosB. A, C, Analiza Pulse-ndjekje që tregon efektin e fosforilimit Ser27 në shkallën e qarkullimit të ΔFosB. Janë paraqitur profilin e degradimit dhe gjysmën e jetëgjatësisë së tipit ΔFosB të tipit të egër (WT), Ser27 në mutantin Ala (S27A), dhe serum27 në Asp mutant (S27D). Të njëjtat gjetje janë marrë në qelizat HeLa (A) dhe qelizat PC12 (B, C).
Fosforilizimi i Ser27 stabilizon ΔFosB duke parandaluar degradimin e saj proteasomal
Për të filluar sqarimin e mekanizmit me të cilin fosforilimi i Ser27 stabilizon ΔFosB, kemi ekzaminuar aftësinë e inhibitorëve proteasome MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) dhe epoksomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) për të moduluar shkallën e degradimit të WT dhe S27A mutant ΔFosB. Eksperimentet me ndjekje impulsesh u kryen duke përdorur qelizat PC12 të infektuara me një HSV rekombinant që shprehte ose WT ose S27A ΔFosB dhe trajtoheshin me ose DMSO ose një nga dy inhibitorët proteasome. Këto eksperimente zbuluan se edhe pse shkalla e degradimit të proteinës WT është relativisht e pandjeshme ndaj pranisë së njërit prej dy inhibitorëve proteasome (Fig 7A), ajo e mutantit S27A është e ndjeshme ndaj këtyre barnave (Fig 7B). Kjo tregon se, ndryshe nga proteina WT, mutanti S27A është një objektiv i degradimit proteasomal. Në të vërtetë, trajtimi i qelizave me ose MG132 ose epoksomicin tërhoqi plotësisht efektin e mutacionit S27A në shkallën e degradimit të ΔFosB, dëshmuar nga një rritje në gjysmën e jetës së mutantit S27A nga ~ 4 në ~ 9 h për MG132 dhe në ~ 12 h për epoksomicin (Fig 7B). Së bashku, këto rezultate tregojnë se fosforilimi i ΔFosB në Ser27 mbron proteinë nga degradimi proteasomal dhe prandaj është thelbësore për stabilitetin e tij të pazakontë.
Shiko versionin më të madh:
Figura 7.
Fosforilizimi i Ser27 stabilizon ΔFosB duke parandaluar degradimin e saj proteasomal. A, B, Analiza Pulse-chase me qelizat PC12 të infektuara me HSV duke treguar profilin e degradimit dhe gjysmën e jetëve të vlerës së ΔFosB të tipit të egër (A) ose S27A ΔFosB (B) në mungesë ose në prani të njërit prej dy inhibitorëve proteasome [MG132 dhe epoxomicin (Epoxo)]. Vini re faktin se as droga nuk ka një efekt të rëndësishëm në qarkullimin e ΔFosB tipit të egër, ndërsa trajtimi i qelizave me ose inhibitor proteasome rezultoi në stabilizimin e S27A ΔFosB. C, Një model për rolin e fosforilimit Ser27 në aftësinë e ΔFosB për të ndërmjetësuar në plakjen afatgjatë të trurit. Pasi nxitet, një pjesë e ΔFosB stabilizohet në trurin nga fosforilimi i S2 i ndërmjetësuar nga CK27. Kjo rezulton në akumulimin e saj, gjë që rezulton me ndryshime afatgjata në shprehjen e gjeneve. Këto ndryshime të qëndrueshme në shprehjen e gjeneve kontribuojnë në përshtatje të qëndrueshme të sjelljes. Anasjelltas, defosforilimi i S27 nga Ser / Thr fosfataza PP1 dhe / ose PP2A rezulton në destabilizimin e proteinës dhe përpunimin e saj nga makineritë proteasomale.
Seksioni i mëparshëmSeksioni tjetër
Diskutim
Në studimin aktual, ne tregojmë se ΔFosB ka një jetë gjysmë të ~10 h në kulturën e qelizës, gjë që e bën të qëndrueshme në krahasim me FosB-në e plotë dhe shumicën e faktorëve të tjerë të transkriptimit inducibilë, gjysma jetët e të cilëve në kulturën qelizore mund të jenë aq të shkurtra si disa minuta dhe rrallë tejkalojnë 3 h (Hann dhe Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts dhe Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Përveç kësaj, ne gjejmë se ΔFosB është fosforiluar në tru dhe se fosforilimi i saj është i ndjeshëm ndaj acidit okadaik të inhibitorit PP1 / PP2A. Studimet e kulturës sonë qelizore tregojnë se stabiliteti i ΔFosB modulohet nga CK2, me aktivitet më të lartë CK2 që stabilizon proteinën. Së fundmi, gjetjet tona sugjerojnë që CK2 fosforilon ΔFosB në një serinë të mbartur N të lartë (S27) dhe të demonstrojë se fosforilimi i S27 mbron ΔFosB nga degradimi proteasomal. Prandaj ne propozojmë një model në të cilin fosforilimi i ΔFosB në S27 nga CK2 është një mekanizëm kritik rregullator i qarkullimit të ΔFosB (Fig 7C). Stabilizimi i tillë i fosforilimit të ndërmjetësimit të ΔFosB është funksionalisht i rëndësishëm, sepse nivelet në rritje të ΔFosB në rajone të caktuara të trurit janë treguar të rregullojnë drejtpërdrejt gjenet e shumta neurone in vivo dhe të ushtrojnë efekte të fuqishme të sjelljes në modelet e kafshëve të disa çrregullimeve neuropsikiatrike (shih Hyrje).
Megjithëse fosforilimi është një mënyrë e shpejtë dhe e kthyeshme e rregullimit të aktivitetit transkripcional të faktorëve transkriptues të caktuar, siç është CREB (proteina lidhëse e elementit të reagimit të cAMP) (Bohmann, 1990), duke moduluar degradimin e faktorëve të transkriptimit, siguron një formë edhe më të fuqishme (më pak të lehtë kthyese) të rregullimit (Desterro et al., 2000). Faktorët e transkriptimit, aktiviteti funksional i të cilit është i rregulluar në nivelin e degradimit të tyre përfshijnë NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), dhe c-Fos (Ferrara et al., 2003), ndër të tjera. Në shumë raste, fosforilimi është një rregullator kyç i stabilitetit të një faktori transkriptimi, siç është treguar për c-Fos (Okazaki dhe Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-lidhur antigjen-1 (Fra-1) (Vial dhe Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-qershor (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), dhe p53 (Buschmann et al., 2001). Studimet tona shtojnë ΔFosB në këtë listë të faktorëve të transkriptimit aktiviteti i të cilit funksional është i rregulluar nëpërmjet stabilitetit të saj të fosforiluar.
CK2 është një ser / Thr kinaza e kudogjendur dhe konstitutive aktive që ka> 300 substrate të pretenduara të identifikuara deri më tani dhe është e implikuar në procese të shumta biologjike, përfshirë vdekjen dhe mbijetesën e qelizave (Litchfield, 2003; Unger dhe të tjerët, 2004), përgjigjet e stresit qelizor (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), dhe riparimin e ADN-së dhe rimodelimin e kromatit (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Më shumë se një e treta e substrateve të supozuara të CK2 janë proteina të përfshira në rregullimin e shprehjes së gjeneve (Meggio dhe Pinna, 2003). Në fakt, CK2 është treguar të jetë një kinazë bërthamore e shquar (Krek et al., 1992) (për shqyrtim, shih Yu et al., 2001) dhe për të bashkëvepruar me domenet bZIP të disa faktorëve të transkriptimit (Yamaguchi et al., 1998). Gjithashtu, fosforilimi i ndërmjetësuar nga CK2 ka treguar të modulojë degradimin (ose rritjen ose zvogëlimin e saj) të shumë proteinave, duke përfshirë IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres dhe Pulido, 2001), lidhja e lente (Yin et al., 2000), proteina e lidhur me kromatin HMG1 (Wisniewski et al., 1999), dhe disa faktorë transkriptimi si HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), dhe c-Myc (Channavajhala dhe Seldin, 2002). CK2 është më e bollshme në tru (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), dhe aktiviteti i saj është implikuar në shumë aspekte të funksionit të trurit, duke përfshirë mbijetesën neurone (Boehning et al., 2003), diferencimi (Nuthall et al., 2004), funksioni i kanalit të joneve (Jones dhe Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), dhe fuqizimi afatgjatë dhe plasticiteti neuronal (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman dhe Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Përkundër kësaj dëshmie në rritje për rolin e CK2 në rregullimin e funksionit neuronal, pak dihet për atë që kontrollon aktivitetin e saj. CK2 mendohet të jetë konstitutivisht aktiv, me rregullimin e aftësisë së saj për fosforilimin e substrateve specifike duke u mbështetur kryesisht në ndryshimet në lokalizimin e tij intracellular (p.sh. citosol vs bërthamë) (Ahmed dhe Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Ky informacion ngre një pyetje të rëndësishme lidhur me sinjalet që kërkohen për të nxitur akumulimin e FosB në tru pas stimulimit kronik (Fig 7C). Një kërkesë është përsëritur aktivizimi i fosB gjen dhe induksioni i ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Të dhënat tona tregojnë se fosforilimi i CK2 i ΔFosB është kritik për stabilitetin e tij, duke sugjeruar që një sinjal i dytë mund të kërkohet për efektet afatgjata të ΔFosB në shprehjen e gjeneve, pra një sinjal që stimulon fosforilimin e proteinave nga CK2. Kjo mund të përfshijë aktivizimin e CK2 nga ndonjë mekanizëm i panjohur ose translokimi i tij në bërthamë. Përndryshe, fosforilimi i CK2 i ΔFosB mund të jetë konstitutiv, kështu që si proteina ΔFosB është përkthyer në përgjigje të secilit stimul, një pjesë e saj merr fosforiluar dhe në këtë mënyrë stabilizohet, kështu që me stimulim të përsëritur akumulon në nivele të larta në neuronet e prekura.
Gjetjet tona tregojnë se CK2 dhe S27 ndoshta nuk janë vetëm kinaza dhe vendi përgjegjës për fosforilimin ΔFosB, sepse as frenimi i CK2 dhe as S27A mutacion nuk ishin në gjendje të parandalonin plotësisht fosforilimin e fosforilimit ΔFosB. Në të njëjtën mënyrë, fakti që mutacioni S27A rezulton në reduktimin e 30% në fosfo-ΔFosB argumenton se S27 është një vend i rëndësishëm i fosforilimit në proteinë. Ne jemi, megjithatë, duke hetuar kinazat e tjera të supozuara dhe vendet e fosforilimit në ΔFosB. Në fund të fundit, do të jetë e rëndësishme gjithashtu për të analizuar fosforilimin e S27 dhe çdo faqe tjetër fosforilimi në ΔFosB në tru in vivo pas llojeve të ndryshme të stimulimit kronik, për shembull, përmes përdorimit të spektrometrisë masive ose antitrupave fosfospecifik.
Siç u përmend më lart, S27 në ΔFosB është shumë e konservuar gjatë evolucionit dhe në mesin e proteinave të tjera të familjes Fos. Megjithatë, faqja e konsensusit për CK2 nuk është: siç tregohet në Figura 5B, vetëm FosB / ΔFosB (dhe xenolog i Zebrafish), por jo c-Fos ose Fra-2, posedojnë një mbetje acidike në + 3, një përcaktues kyç i fosforilimit CK2 (Marin dhe të tjerët, 1986; Meggio et al., 1994). Kështu, mungesa e CK2 fosforilimi në S27 mund të shpjegojë pse proteinat e tjera të familjes Fos nuk janë aq të qëndrueshme sa ΔFosB. Megjithatë, kjo nuk shpjegon pse FosB-i i plotë, i cili ka të njëjtin vend të konsensusit CK2 si ΔFosB, nuk stabilizohet në mënyrë të ngjashme. Ne nuk e dimë nëse FosB me gjatësi të plotë është fosforiluar nga CK2 në këtë mbetje të konservuar. Raportet e vetme të FosB (Skinner et al., 1997) dhe c-Fos (Okazaki dhe Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforilimi përshkruajnë vendet në rajonin C-terminal të këtyre proteinave, të cilat mungojnë në ΔFosB. Fosforilimi i mundshëm i FosB-së me gjatësi të plotë dhe proteinave të tjera të familjes Fos nga CK2 kërkon hetim të drejtpërdrejtë. Sidoqoftë, edhe nëse ato janë fosforiluar, proteinat e tjera të familjes Fos njihen që përmbajnë motive në termat e tyre C që synojnë proteinat për degradim të shpejtë (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Për shembull, është treguar se një shtrirje e mbetjeve ~ 21 të pranishme në terminalin C të të gjitha proteinave të familjes Fos, por që mungon në ΔFosB, vepron si një fushë destabilizuese për c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Ne kemi gjetur se edhe pse kjo sekuencë në mënyrë të ngjashme destabilizon FosB (Carle et al., 2004), mungesa e kësaj fushe në ΔFosB nuk llogaritet plotësisht për stabilizimin e saj. Përkundrazi, kombinimi i mungesës së kësaj domandeje të terminalit C dhe fosforilimi Ser27 duket se përbëjnë plotësisht llogari për diferencën përafërsisht pesëfish të stabilitetit ndërmjet ΔFosB dhe FosB.
Megjithëse degradimi i proteinave të familjes Fos është kompleks dhe nuk kuptohet plotësisht, degradimi proteasomal duket të jetë rruga kryesore e përfshirë (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Të dhënat e paraqitura këtu, në të cilat frenuesit e proteasomal nuk ndryshojnë ndjeshëm shkallën e degradimit të ΔFosB, argumentojnë se, ndryshe nga proteinat e tjera të familjes Fos, ΔFosB shmang X-NUMXS proteasome dhe kjo luan një rol qendror në stabilizimin e tij. Prandaj ne propozojmë një skemë me të cilën stabiliteti i zgjerimit i ΔFosB i atribuohet kombinimit të dy faktorëve kryesorë: (26) mungesa e një derezibilizimi të C-terminalit dhe (1) fosforilimi i S2 nga CK27.
Në përmbledhje, ky studim ofron një pasqyrë mekanik se pse ΔFosB, një produkt i gjenit të menjëhershëm të hershëm fosB, është, ndryshe nga të gjithë anëtarët e tjerë të familjes Fos, një proteinë relativisht jetëgjatë. Megjithëse proteinat e tjera të familjes Fos mendohet të ndërmjetësojnë lidhjen e shpejtë, por të përkohshme stimuluese-transkriptuese (Morgan dhe Curran, 1995), stabiliteti relativ i ΔFosB i jep atij aftësinë për të ndërmjetësuar ndryshimet më të qëndrueshme të transkriptimit të shkaktuara nga stimulimi kronik. Kjo mbështet pikëpamjen se ΔFosB funksionon si një kalim i qëndrueshëm molekular në tru, duke kthyer gradualisht përgjigjet akute në përshtatje kronike. Identifikimi i fosforilacionit Ser27 si një mekanizëm qendror për stabilitetin e ΔFosB hap rrugë të reja për zhvillimin e mjeteve për të rregulluar funksionin e ΔFosB dhe në këtë mënyrë të rregullojë efektet e saj afatgjata mbi plasticitetin nervor dhe të sjelljes.
Seksioni i mëparshëmSeksioni tjetër
Shënimet
- Marrë nëntor 21, 2005.
- Revizioni mori shkurt 21, 2006.
- Pranohet Prill 2, 2006.
- Kjo punë u mbështet nga Aleanca Kombëtare për Hulumtime mbi Shizofreninë dhe Çmimin për Hetimin e Depresionit të Rinj të PGU, një Institut Kombëtar për Shpërdorimin e Narkotikëve (NIDA) për Shërbimin Kombëtar të Kërkimit të Shërbimit të Pushtetit Lokal dhe grante nga Instituti Kombëtar i Shëndetit Mendor dhe NIDA në EJN Ne falënderoj Dr. James Bibb për ndihmën e tij në vitro testet e fosforilimit, Dr. Ming-Hu Han për ndihmën e tij në përgatitjen e fijet e trurit të përdorur për etiketimin metabolik, dhe Dr. Rachael Neve për ndihmën e saj në paketimin e HSV-ve rekombinante.
- Adresa e tanishme e G. Rudenko: Instituti i Shkencave të Jetës dhe Departamenti i Farmakologjisë, Universiteti i Miçiganit, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Korrespondenca duhet t'i drejtohet Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. Email: [email mbrojtur]
Referencat
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikimi i një motivi tripeptid C-terminal i përfshirë në kontrollin e degradimit të shpejtë proteasomal të proto-onkoproteinës c-Fos gjatë tranzicionit të fazës G (0) -to-S. oncogene 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brok F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Shtigjet e degradimit të shumëfishta për proteinat e familjes Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mekanizmi i rregullimit intracellular të protein kinazës CK2: roli i shoqatës subnucleare të ndërmjetësuar nga stimuli. Cell Mol Biol Res 40:539-545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Një procedurë e përmirësuar e pastrimit dhe karakteristikat e kazein kinazës II nga truri. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Kursi kohor i imunoreaktivitetit striatal DeltaFosB dhe nivelet e ARNs prodynorphin pas ndërprerjes së trajtimit kronik dopaminomimetik. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Ekranet e shprehjes të gjinisë tregojnë një rol global për protein kinazën CK2 në rimodelimin e kromatit. J Cell Sci 116:1563-1577.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Beh unë, Schmidt R, Hecker E (1989) Dy izozime të PKC të gjetura në qelizat HL-60 tregojnë një ndryshim në aktivizimin nga esteret forcë fenolore TPA. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Shulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Protein kinaza CK2 është koassembled me kanali të vogël Ca (2 +) - aktivizuar kanalet K + dhe rregullon kanal kanalizim. Neuron 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Shprehja afatgjatë e antigjenit të lidhur me Fos dhe shprehja e përkohshme e delta FosB shoqëruar me konfiskimet në hippocampus dhe striatum të miut. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Parashikimi i glycosylation post-translational dhe phosphorylation e proteinave nga sekuenca amino acid. proteomics 4:1633-1649.
Boehning D, Hëna C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Neurotransmisioni i monoksidit të karbonit i aktivizuar nga fosforilimi CK2 i hem oksigjenazës-2. Neuron 40:129-137.
Bohmann D (1990) Fosforilimi i faktorit të transkriptimit: një lidhje midis transmetimit të sinjalit dhe rregullimit të shprehjes së gjeneve. Qelizat e kancerit 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminali fosforilimi i kinazës së p53 në Thr-81 është i rëndësishëm për stabilizimin e p53 dhe aktivitetet transkriptiale në përgjigje të stresit. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Mungesa e një domeni C-terminal të familjes Fos kontribuon në stabilitetin unik të deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Ndërveprimi funksional i protein kinazës CK2 dhe c-Myc në lymphomagenesis. oncogene 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, MB Kelz, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Rregullimi i proteinave Delta FosB dhe FosB si nga sekuestrimi elektrokonvulsiv dhe trajtimet e kokainës. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, MB Kelz, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Antigjenet kronike të lidhura me Fos: variante të qëndrueshme të ΔFosB të shkaktuara në tru nga trajtimet kronike. J Neurosci 17:4933-4941.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforilimi i c-Fos në C-terminus rrit aktivitetin transformues. oncogene 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Fosfataza proteinike 1 / 2A frenues acid okadaic rrit CYB dhe ELK-1 fosforilim dhe c-fos shprehje në striatum miu in vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Fosforilacionet e proteinave të ndërmjetësuar nga poliamine: një objektiv i mundshëm për veprim intraaminular poliamine. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Vetitë katalitike dhe molekulare të një kinase kazeine të lartë të pastruar nga indet e mushkërive të gjedhit. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Vetë DW (2003) Zmadhimi i tepërt i tipit qelizor striatoz të DeltaFosB rrit nxitjen për kokainë. J Neurosci 23:2488-2493.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Vet-administrimi i kokainës rrit preprodynorfinën, por jo c-fos, mRNA në striatumin e miellit. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Rregullimi i faktorëve të transkriptimit nga degradimi i proteinave. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Rritja e aktivitetit cytoplazmatik të kazein kinazës II shoqëron rritjen e neuritit pas frenimit të sintezës së ADN-së në qelizat neuroblastoma të NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kinaza CK2 phosphorylates dhe upregulates Akt / PKB. Vdekja e qelizave 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Të dy produktet e fosB gjen, FosB dhe forma e saj e shkurtër, FosB / SF, janë aktivatore transkriptiale në fibroblastet. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, F Brockly, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Përcaktuesit strukturorë përgjegjës për degradimin proteasomal të proteinës c-Fos ndryshojnë sipas kushteve të shprehjes. oncogene 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Qëllimi i varur nga fosforilimi i cakunit c-Jun nga Jun N-kinaza. oncogene 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminal kinazat synojnë ubiquitination e faktorëve të tyre transkriptimin e lidhur. J Biol Chem 272:32163-32168.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabiliteti i faktorit të transkriptimit ATF2 është i rregulluar me fosforilim dhe defosforilim. J Biol Chem 275:12560-12564.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforilimi i DARPP-32, një phosphoprotein dopamin- dhe cAMP-rregulluar, sipas kazein kinazës II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Girault JA, Hemmings HC Jr., Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterizimi në trurin e gjitarëve të një serine kinaze DARPP-32 identike me kazein kinazën II. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoksomicin, një agjent i ri antitumor me origjinë mikrobiale. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteinat e koduar nga oncogene c-myc e njeriut: shprehje diferenciale në qelizat neoplastike. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, një fosfoprotein ciklik AMP-rregulluar (Mr = 21,000), i pasuruar në rajonet e trurit të innervuar dopamine. Sekuenca aminoacidike e vendit fosforiluar nga AMP ciklike në qelizat e paprekura dhe studimet kinetike të fosforilimit të saj në vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Farmaceutikë e inhibitorëve të proteinave kinase. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Paqëndrueshmëria e proteinës Hes7 është vendimtare për orën e segmentimit somite. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Trajtimet atipike dhe tipike neuroleptike nxisin programe të dallueshme të shprehjes së faktorit të transkriptimit në striatum. J Comp Neurol 374:70-83.
Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Rregullimi i shprehjes së menjëhershme të gjeneve të hershme dhe lidhjes AP-1 në bërthamën e miut të akumuluar nga kokaina kronike. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Shpresoj BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Trajtimi kronik elektrokonvulues (ECS) rezulton në shprehjen e një kompleksi AP-1 afatgjatë në tru me përbërje dhe karakteristika të ndryshuara. J Neurosci 14:4318-4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Vetë DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induksioni i një kompleksi AP-1 afatgjatë të përbërë nga proteinat e ndryshuara të Fos-it në tru me kokainë kronike dhe trajtime të tjera kronike. Neuron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilizimi i proteins kinazës II të varur nga kalmodulin përmes domenit autoinhibitor. J Biol Chem 270:2163-2170.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Mekanizmat komplekse për degradimin c-fos dhe c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Kazeina kinaza ii (protein kinaza ck2) rregullon funksionin e kanalit të receptorit të serotonin 5-ht (3) në qelizat ng108-15. Neuroscience 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 është një C-terminali IkappaB kinase përgjegjës për aktivizimin NF-kappaB gjatë reagimit UV. Mol Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Vetë DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Shprehja e faktorit të transkriptimit deltaFosB në tru kontrollon ndjeshmërinë ndaj kokainës. Natyrë 401:272-276.
Kim Kim, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Frenimi proteasome nga produktet natyrore epoxomicin dhe dihydroeponemycin: njohuri në specifikë dhe potencë. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), një kompleks i ri mikrobik, është një frenues mjaft i fuqishëm dhe specifik i proteinës kinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kazeina kinaza II është një enzimë mbizotëruese bërthamore. J Cell Biol 116:43-55.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Protein kinaza CK2 phosphorylates lartë grupin e mobilitetit domain proteina SSRP1, duke shkaktuar njohjen e UV-dëmtuar ADN. J Biol Chem 278:12710-12715.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Vetë DW, Nestler EJ (2005) Remodeling kromatin është një mekanizëm kyç që bazon plasticitetin e shkaktuar nga kokaina në striatum. Neuron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Kazeina kinase-II rregullon funksionin e kanalit NMDA në neuronet hipokampale. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Protein kinaza CK2: struktura, rregullimi dhe roli në vendimet celulare të jetës dhe vdekjes. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradimi i proteines c-Fos shprehur nga N-metil-d-aspartiak në fraksione bërthamore të hippocampus murine. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Mungesa e një antigjeni të lidhur ngushtë me 37 kDa fos dhe veprimtaria e detyrueshme e AD-1-së që lidhet me ADN-në në trurin e minjve të fosb null të trajtuara me acid kainik. J Neurosci 17:5407-5415.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Specifikat e sitit të kazein kinazës-2 (TS) nga citozoli i mëlçisë së miellit. Një studim me substrate peptide model. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Rregullimi i shprehjes së gjeneve dhe shpërblimi i kokainës nga CREB dhe DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: një kalim molekular për përshtatjen afatgjatë në tru. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Një mijë e një substrate të protein kinazës CK2? FASEB J 17:349-368.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforilimi i fraksioneve të kazeinës nga 'fosvitin kinaza' në mëlçinë e miut. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforilimi i kazein kinazës TS të llojit 2 në të dy nën-njësitë e tij alfa dhe beta. Ndikimi i efektorëve të ndryshëm. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Derivatet ribofuranozil-benzimidazol si frenues të kazein kinazës-2 dhe kazein kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Specifikimi i substancës së proteinës kinase CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, Ai Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Induksioni transkripcional i gjenit ciklooksigenazë-2 nga frenimi i acidit okadaik të aktivitetit të fosfatazës në condrocytes humane: bashkë-stimulimi i proteinave lidhëse bërthamore AP-1 dhe CRE. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Ndryshimet në nivel rrjeti në shprehjen e proteinave Fos-Jun të induktueshme në striatum gjatë trajtimit kronik të kokainës dhe tërheqjes. Neuron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Gjenet e menjëhershme-të hershme: dhjetë vjet më vonë. Trendet Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Një formë e prerjes natyrale e prerë e FosB që pengon aktivitetin transkripsion Fos / Jun. Qelizë 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Vetë DW (2001) Delta FosB: një kalim i qëndrueshëm molekular për varësinë. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Futja e subunitit të receptorit të glutamatit 1 në neuronet motorike in vitro dhe in vivo duke përdorur një virus rekombinant herpes simplex. Neuroscience 79:435-447.
Nuthall HN, Joakim K, Stifani S (2004) Fosforilimi i serinës 239 të Groucho / TLE1 nga protein kinaza CK2 është i rëndësishëm për ndalimin e diferencimit neuronal. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Okazaki K, Sagata N (1995) Rruga Mos / MAP kinazë stabilizon c-Fos nga fosforilacioni dhe rrit aktivitetin transformues në qelizat NIH 3T3. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Rruga ubiquitin-proteasome është e nevojshme për përpunimin e proteinës prekursore NF-kappa B1 dhe aktivizimin e NF-kappa B. Qelizë 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Degradimi i synuar i c-Fos, por jo v-Fos, nga një sinjal i varur nga fosforilimi në c-qershor. Shkencë 258:1941-1944.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Inducible, shprehja specifike e rajonit të trurit të një mutanti dominant negativ të c-Jun në minj transgenic zvogëlon ndjeshmërinë ndaj kokainës. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Uleri PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induksioni i DeltaFosB në strukturat e trurit të lidhura me shpërblimin pas stresit kronik. J Neurosci 24:10594-10602.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Faktori i faktorit të transkriptimit të trurit: efektet e amfetaminës akute dhe kronike dhe stresi i injektimit. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Modifikimi post-translational: phosphorylation dhe phosphatases. Në: Protokollet aktuale në shkencën e proteinave (Dunn BM, ed.) F. 13.01-13.02. Nju Jork: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Vetitë katalitike dhe molekulare të fosvitit / kazein kinazës II të lartë të pastruar nga qelizat epiteliale të njeriut në kulturë (HeLa) dhe lidhja me ecto protein kinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Statusi i sistemit të "protein kinazës CK2-HMG14" në amnezinë e lidhur me moshën në minjtë. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradimi i receptorit themelor të dioksinës së homologjisë së helixit bazë spirale-helix / Per-ARNT-Sim nëpërmjet rrugës ubiquitin / proteasome. J Biol Chem 274:36351-36356.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Serveri i PredictProtein. Acidet nukleike Res 32:W321-W326.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Qëllimet Ap-1 në tru. Front Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, SE Ealick, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Karakterizimi molekular i adenosin kinazës rekombinant të miut dhe vlerësimi si një objektiv për fosforilimin e proteinave. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Stef AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) A ka shtigje të shumëfishta proteolitike që kontribuojnë në degradimin e proteinave c-Fos, c-Jun dhe p53 në vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autoksidimi i estereve të forbolit nën kushte normale magazinimi. Cancer Res 35:1375-1377.
Shvarc EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Fosforilimi konstitutiv i IkappaBalpha nga kazein kinaza II ndodh në mënyrë preferenciale në serinë 293: kërkesa për degradimin e IkappaBalpha të lirë. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras rrit stabilitetin e proteinave Myc. Mol Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Fosforilimi ciklik i nukleotideve i pavarur nga vitellina nga kazeina kinaza II i pastruar nga oocitët prolixus Rhodnius. Insektet Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Aktivizimi transkripcional dhe transformimi nga proteina FosB kërkojnë fosforilimin e domenit të aktivizimit të terminalit karboksil. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Protein kinaza CK2 në mënyrë të diferencuar phosphorylates proteinat e grupit B (HMGB) të lartë të lëvizjes kromozomale të misrit që modulojnë qëndrueshmërinë e tyre dhe ndërveprimet e ADN-së. J Biol Chem 277:1092-1098.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikimi i cyk, një ciklin B2 kinase, si një novel kalciumi / kinodina II e varur nga kollodulina dhe roli i saj gjatë maturimit të oocitës së Xenopus laevis. Exp Cell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Rregullimi i ekspresionit të gjenit të c-fos dhe c-jun nga lipopolisaharidi dhe citokinet në astrocitet primar të kultivuara: efekti i rrugëve PKA dhe PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Fosforilimi diferencial i proteinave acid ribosomale nga qeliza e majave nga dy proteinat endogjene proteinike: kazein kinaza-2 dhe 60S kinase. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) dhe komponimet e lidhura me calphostin, një klasë e re e inhibitorëve specifikë dhe të fuqishëm të protein kinazës C. Adv Messenger i Dytë i Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) Tumor suppressor PTEN është fosforiluar nga protein kinaza CK2 në terminin C të saj. Implikimet për stabilitetin e PTEN-së në degradimin e ndërmjetësuar nga proteasome. J Biol Chem 276:993-998.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Ndalimi diferencues i aktiviteteve të kalpainit dhe proteasomës nga aldehidet peptidil të di-leucines dhe tri-leucine. J Biochem (Tokio) 119:572-576.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradimi i c-Fos nga proteasome 26S përshpejtohet nga c-Jun dhe proteinat e shumta proteinike. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Protein kinaza CK2 si rregullator i mbijetesës së qelizave: implikimet për terapi të kancerit. Curr Cancer Targetet e drogës 4:77-84.
Shishja E, Marshall CJ (2003) Aktiviteti i lartë i ERK-MAP kinazit mbron anëtarin e familjes FOS FRA-1 kundër degradimit të proteasomal në qelizat e karcinomave të zorrës së trashë. J Cell Sci 116:4957-4963.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB rregullon drejtimin e rrotave. J Neurosci 22:8133-8138.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Rregullimi i funksionit të faktorit të transkriptimit nga fosforilimi. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.
Dimri B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Dy vende të konsiderueshme të fosforilimit të protein kinazës CK2 janë të rëndësishme për aktivitetin Myf-5. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petri I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Fosforilimi konstitutiv i bishteve acidike të proteinave të grupit të lartë të lëvizshmërisë 1 nga kazeina kinaza II ndryshon konformitetin, stabilitetin dhe specifikat e lidhjes së ADN-së. J Biol Chem 274:20116-20122.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kazeina kinaza II ndërvepron me domenet bZIP të disa faktorëve të transkriptimit. Acidet nukleike Res 26:3854-3861.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforilimi i proteinave të stresit A170 nga veprimtaria e kazein kinazës II në makrofagjet. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Frenuesi i zgjatjes transkriptiale 5,6-dikloro-1-beta-d-ribofuranozilbenzimidazol pengon faktorin e transkriptimit të proteinës kinase të lidhur me IIH. J Biol Chem 270:23922-23925.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Jen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) Një formë alternative spliced e FosB është një rregullator negativ i aktivizimit dhe transformimit të transkriptimit nga proteinat Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kazeina kinase II phosphorylates lente connexin 45.6 dhe është i përfshirë në degradimin e saj. J Biol Chem 275:6850-6856.
Abstrakt / FALAS Tekst i Plotë
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induksioni i komponentëve të faktorit të transkriptimit AP-1 gjatë aktivizimit të T-qelizave nga interleukin 1 dhe esteret e forbolit. Ndryshimet e rritjes së qelizave 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Pasojat e sinjalizimit CK2 në matricën bërthamore. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Qëllimi i diferencuar i kinazës proteinike CK2 në matricën bërthamore pas mbizotërimit të përkohshëm të nën-njësive të saj. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: një rol thelbësor për ΔFosB në bërthamën accumbens në veprim morfine. Nat Neurosci 9:205-211.
Artikuj që citojnë këtë artikull
- Sjelljes dhe Strukturore Përgjigjet në Kokainë Kronike Kërkojnë një Loop Feedforward që përfshin {Delta} FosB dhe Kalciumi / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II në Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 Mars 2013, 33(10):4295-4307
- Shtrirja e striatumit të {Delta} FosB riprodhon lëvizjet kronike të detyruara Levodopa Journal of Neuroscience, 26 Maj 2010, 30(21):7335-7343
- Abstrakt
- Teksti i plotë
- Teksti i plotë (PDF)
- Abstrakt
- Teksti i plotë
- Teksti i plotë (PDF)
- Abstrakt
- Teksti i plotë
- Teksti i plotë (PDF)
- Abstrakt
- Teksti i plotë
- Teksti i plotë (PDF)
- Mekanizmat transkripcionalë të varësisë: roli i {Delta} FosB Transaksionet Filozofike të Shoqërisë Mbretërore B: Shkencat Biologjike, 12 tetor 2008, 363(1507):3245-3255
- Qëndrueshmëria e cenueshmërisë për rivendosjen e sjelljes që kërkon metamfetaminën në minj mutante të faktorit neurotrofik të linjës së qelizave gliale Gazeta FASEB, 1 Korrik 2007, 21(9):1994-2004
- Activator Protein-1 Faktori i Transkriptimit në Karcinogjenezën e Epitelit të Duhur Hulumtimi i kancerit molekular, 1 Shkurt 2007, 5(2):109-120
;