Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor dhe attenuates Signalization Downstream (2013)

Citation: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor dhe attenuates sinjale në rrjedhën e sipërme. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Redaktor: James Porter, Universiteti i North Dakota, Shtetet e Bashkuara të Amerikës

marra: Maj 20, 2013; pranuar: Nëntor 14, 2013; Publikuar: Dhjetor 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Ky është një artikull me akses të hapur të shpërndarë nën kushtet e Creative Commons Attribution License, e cila lejon përdorimin, shpërndarjen dhe riprodhimin e pakufizuar në çdo medium, me kusht që autori dhe burimi origjinal të kreditohen.

financimi: Kjo punë u mbështet nga grantet (NRF-2012R1A2A2A01012923 dhe NRF-2012R1A4A1028200) nga qeveria koreane (MSIP) dhe gjithashtu u mbështetën në kuadrin e programit të bashkëpunimit ndërkombëtar të menaxhuar nga NRF të Koresë (2012K2A1A2033117) dhe Instituti i Kërkimit të Trurit të Koresë (KBRI) Programi Bazë i Kërkimit i MSIP (2031-415). SKP ishte marrëse e Aleancës Kombëtare 2004 dhe 2006 për Hulumtime mbi Shizofreninë dhe Depresionin (NARSAD). Financuesit nuk kishin rol në hartimin e studimeve, grumbullimin dhe analizën e të dhënave, vendimin për botimin, ose përgatitjen e dorëshkrimit.

Interesat konkurruese: Autorët kanë deklaruar se nuk ekzistojnë interesa konkurruese.

Prezantimi

Sinjalizimi i dopamines është i përfshirë në funksione të ndryshme të trurit duke përfshirë koordinimin e motorëve, kontrollin e humorit dhe mekanizmat e shpërblimit [1]. Një komponent i rëndësishëm i sinjalizimit të dopaminës në vertebrorët është ushtruar nga neurone mesatare striatare (MSNs) që selektivisht shprehin një mesin e recetave të dopaminës dhe marrin kontribut dopaminergjik kryesisht nga zona tegmentale ventrale (VTA) dhe substantia nigra (SN) [2]. Receptorët e dopaminës janë G receptorë të proteinave të lidhura (GPCR) me shtatë domene transmembrane dhe përbëhen nga dy nëntipe, Receptorë të ngjashëm me D1 dhe D2, që ndërmjetësojnë veprime reciproke në sinjalizimin dopamine [1]. Për shembull, dopamine D1-si receptorët (D1, D5) aktivizojnë adenilil ciklazë përmes G_αs dhe për të rritur nivelin intracellular të cAMP, por receptorët dopaminë D2-like (D2, D3, D4) pengojnë adenylil ciklase nëpërmjet G_αi dhe uljen e nivelit intracellular të cAMP [1], [3].

Në mesin e receptorëve dopamikë, receptori D2 (DRD2) është i implikuar në patofiziologji të çrregullimeve të shumta psikiatrike të mëdha, duke përfshirë skizofreninë dhe varësinë e drogës [4], të tilla që shumë droga antipsikotike të paktën të synojnë pjesërisht DRD2. Dihet gjithashtu se aktiviteti DRD2 korrespondon mirë me pasojat e sjelljes së drogave të abuzimit në modelet e kafshëve [5]. Masat kundër depresionit dhe efikasiteti i stabilizatorit të disponimit janë gjithashtu të lidhura me ndryshimet në shprehjen e sipërfaqes së qelizës të DRD2 ose sinjalizimit intracelular të poshtëm të ndërmjetësuar nga PKA, ERK dhe GSK3 [1], [4], [6]. Pavarësisht këtyre roleve kritike për DRD2 në tru, mekanizmat e hollësishëm rregullatorë që u japin heterogjenitet dhe kompleksitet pronave DRD2 nuk kuptohen plotësisht.

Linjat konvergjente të provave tregojnë se modifikimet e shumta posttranslazionale janë të përfshira në rregullimin e imazhit të aktivitetit DRD2. Glikozilimi i gjerë i DRD2 u zbulua në studimet e hershme të etiketimit me foto-affinity [7], dhe formimi i lidhjes disulfide brenda DRD2 u identifikua gjithashtu si një modifikim i rëndësishëm për lidhjen e ligandit [8]. Për më tepër, vendet e fosforilimit të DRD2 fillimisht janë identifikuar nga vitro analiza me radioizotopet, duke siguruar rrugë për rrugë të ndryshme rregullatore të ndërmjetësuar nga kinaza të ndryshëm [9]. Në të vërtetë, protein kinaza C (PKC) rregullon mobilizimin e kalciumit intracellular të ndërmjetësuar nga DRD2 dhe modulon ndërveprimin e DRD2 me proteinat citoskeletale [10]. Fosforilimi nga GPCR kinaza 2 (GRK2) rregullon modelet e resensitizimit të agonistëve të DRD2 [11].

Kinazina e varur nga ciklin 5 (Cdk5) është një kininë serine / treonine e drejtuar nga prolina që ka veprimtari preferenciale për shkak të shprehjes specifike të trurit të aktivatorëve të saj esenciale, p35 dhe p39 [12]. Cdk5 është i përfshirë në procese të ndryshme neuronale duke përfshirë migrimin neuronik dhe udhëzimin e akseve, dhe Cdk5 dhe p35 minjtë nullor shfaqin defekte në shtresimin kortikal [13]. Kohët e fundit, u tregua se fosforilimi i WAVE1 dhe ephexin nga Cdk5 rregullon morfogenezën e shtyllës së dendritit [14]. Për më tepër, Cdk5 gjithashtu rregullon nivelet e shfaqjes sipërfaqësore të receptorit NMDA, NR2B, dhe rrymat NMDA të ndërmjetësuar nga NR2A [15], [16]. Vlen të përmendet se pjesë të shumta të provave sugjerojnë një marrëdhënie intime mes Cdk5 dhe sistemit dopaminë. Cdk5 phosphorylates tyrosine hydroxylase (TH), rregullimin e stabilitetit të saj, dhe kështu mbajtjen e homeostasis dopaminergic [17]. Në neuronet postinaptike, kur mbetjet T75 të dopaminës dhe fosfoprotein-32kD (DARPP-32) të rregulluar ciklik-AMP është fosforiluar nga Cdk5, ajo mund të pengojë aktivitetin PKA dhe kështu të antagonizojë sinjalizimin PKA të ndërmjetësuar me dopamine DRD1 [18]. Është interesante që kur kokaina, një agonist i tërthortë i receptorëve dopamin, administrohet kronikisht në minjtë, nivelet e ARNi dhe proteinave të rritjes Cdk5 në neuronet e mesme [19]. Kolektivisht, Cdk5 duket të jetë i përfshirë në adaptimet synaptike të nxitura nga droga. Në këtë studim, ne tregojmë një ndërveprim funksional të DRD2 dhe Cdk5 që shtrijnë më tej rolin e Cdk5 në sinjalizimin dopamine.

Materialet dhe Metodat

antitrupat

Serum anti-lepuri u ngritën kundër peptideve që përmbajnë fosfo-serinë 321 (pS321) të lakit të tretë intracelular të DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), u përdor për të bërë një kolonë të konjuguar peptid për pastrimin e afinitetit (20401, PIERCE). Antitrupi Anti-pS321 u pasurua nga një sistem i purifikimit të afinitetit duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. Antitrupi fosfo-fosfat i pastruar u ruajt në PBS me 0.1% azide natriumi dhe 0.1% xhelatinë. Anti-mouse anti-Cdk5 antitrup (sc-249) dhe anti-lepuri anti-p35 antitrup (sc-820) janë përdorur për Western blotting dhe immunocytochemistry e Cdk5 / p35. Antitrup anti-Mouse anti-GFP (sc-9996) është përdorur për imunoprecipitimin dhe blotting perëndimore të DRD2-GFP. Anti-lepuri anti-FLAG antitrup (sc-807), anti-lepuri anti-HA antitrup (sc-805), anti-mouse anti-GST antitrup (sc-138), anti-mouse anti-GAPDH antitrup (sc- 32293) janë blerë nga Santa Cruz Biotechnologies.

kafshët

P35 miu i thyer ishte një dhuratë e mirë nga Dr. Katsuhiko Mikoshiba në RIKEN Institutin e Shkencës Brain në Japoni dhe përdoret për kulturën e neuronit primar. Grupet primare për gjenotipim ishin 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC dhe 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT siç përshkruhet më parë [20]. Minj ICR dhe rats Sprague Dawley u përdorën për përgatitjen e lizës së trurit. Të gjitha procedurat e kafshëve u miratuan nga Komiteti Institucional i Kujdesit dhe Përdorimit të Kafshëve të Universitetit të Shkencës dhe Teknologjisë Pohang.

Plasmid ndërton

Njësia humane DRD2 e gjatë në një vektor plasmid EGFP-N1 dhe lak i tretë intracellular i DRD2 (mbetjet aminoacidike të 212-373 duke përfshirë mbetjet shtesë të aminoacideve 29 unike ndaj DRD2 gjatë izoformës) në një vektor plasmid pFLAG-CMV-2. Humani Cdk5 u vendos në një vektor plazmid pCMV-HA dhe p35 humane u fut në një vektor plazmid xNUMX pcDNA. Humani Cdk3.1 u fut nën një promotor të citomegalovirusit (CMV) së bashku me p5 të njeriut në një vektor pcNNA XNAUMX për të bërë një konstrukt të dyfishtë të shprehjes (Cdk35 / p3.1) për imunocitokimizëm,³⁵S] -GTP_γS, lidhja bindëse radioligand dhe immunoassay enzimë cAMP.

In Vitro Analiza e Kinazës

IP-lidhur vitro kinazës është kryer si më poshtë. Një tru i tërë miu është lysed në 3 mL eritrocitet lysis buffer (ELN) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) nga goditje 20 e një homogjenizuesi Dounce për të marrë lizate të trurit të homogjenizuar . Lysatet u inkubuan në akull për 30 min, sonicated, dhe centrifuguar në 16,000 × g për 10 min. Supernatantët u imunoprecipituan me anti-antitrupa anti-lepuri anti-p35 për të marrë një kompleks aktiv Cdk5 / p35. Cdk5 / p35 proteina e shkrirjes komplekse dhe e pastruar GST u përzier me adenosine 5'-triposphate, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) dhe inkubuar në tampon kinazë (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) për 1 h në temperaturën e dhomës [18], [21]. Kompleksi i pastruar Cdk5 / p25 (14-516, Millipore) është përdorur gjithashtu për vitro kinazës siç është përshkruar më sipër. Tampon ngarkimi i mostrës 2 × është shtuar në përzierjen e reagimit dhe është zier në 100 ° C. Mostrat pastaj u nënshtruan SDS-PAGE dhe xhel i thatë u vlerësua me autoradiografi.

Spektrometria e Liquid Chromatography (LC) -Mass (MS) / MS Analiza

Proteina GST-D2i3 rekombinante u analizua nga LC-MS / MS duke ndjekur IP-të lidhura vitro kinazë. Ne kemi kryer identifikimin e peptideve të të dhënave LC-MS / MS duke përdorur X !! Tandem (versioni Dec-01-2008). Çdo skedar RAW i të dhënave u konvertua së pari në mzXML duke përdorur tubacionin trans-proteomik (TPP, versioni 4.3). Skanimet MS / MS në mzXML-të e konvertuara u nënshtruan pastaj në kërkim të bazës së të dhënave të sekuencës së sekuencës së miut UniProt (lëshimi 2010_07) duke përfshirë sekuencën GST-D2i3 duke përdorur X !! Tandem. Toleranca ishte vendosur në 3 Da për jonet pararendëse dhe 2 Da për jonet e fragmentuara. Specifikimi enzimë për trypsin është përdorur. Opsionet e modifikimit të ndryshueshëm u përdorën për karbamidometilimin e cisteinës (57.021 Da), oksidimin e metionines (15.995 Da), hidrolizën e asparaginës (0.987 Da) dhe fosforilimin e serinës (79.966 Da).

imunoprecipitim

Imunopresidimi u krye në lizat e qelizave në buferin ELIS të lizës. Antitrupi Anti-GFP u shtua në lysate dhe inkubohej për 3 h në 4 ° C. Imunokomplekset u pastruan duke përdorur agarozën e proteinave A. Precipitat u inkubuan me tampon ngarkimi mostër SDS për 30 min në 37 ° C, dhe u nënshtruan SDS-PAGE dhe Western blots.

Analiza GST tërheqëse

10 μg të GST dhe GST-D2i3 të pastruar u inkubuan me lizën e trurit të trurit për 1.5 h në 4 ° C. 30 μL e rruaza Sepharose 4B (17-0756-01, GE Healthcare) të konjuguar me glutation (GSH) të ekuilibruar me tampon lizi u shtua dhe inkubohej për 1 shtesë h. Rruaza u mblodhën me centrifugim në 2,000 ×g dhe të shpëlarë me tampon lysis 4 herë [22], [23]. Precipitat u analizuan me Western blotting duke përdorur anti-Cdk5 dhe anti-p35 antitrupa.

Imunocytokimia

HEK qelizat 293 të transfektuara dhe neuronet striatare të kultivuara në mbulesat e mbulimit u lanë një herë me kripërat e fosfateve të zbutura (PBS) dhe u fiksuan me zhytje në 4% paraformaldehyde / PBS për 30 min. Antitrupi primar u hollua në solucionin bllokues (serum 2% kali dhe 1% Triton X-100 në PBS). Antitrupat anti-miu (A647, Invitrogen) dhe Alexafluor-20990-konjuguar anti-lepuri (A568, Invitrogen) janë përdorur si antitrupat sekondarë. Hoechst u përdorën për bërthamën e bërthamës. Imazhet janë marrë nga mikroskopi confocal (Olympus, FluoView-11011).

Analiza e brendshme e receptorit

24 h pas transfektimit, qelizat u trajtuan me 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) për 30 min dhe 90 min në 37 ° C. Qelizat u ri-pezullohen në 2 mL FBS të ftohtë dhe aliquote 200 μL janë përdorur për çdo reaksion. Trajtimet e drogës janë kryer në temperaturën e dhomës për 3 h në përqëndrimet e mëposhtme; 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), XIIUMMM sulpirid (3, TOCRIS), 895 μM haloperidol (H10, Sigma). Hidrofobik [³H] -spiperone është përdorur për të etiketuar receptorët total të shprehur dhe sulpirid hidrofilik është përdorur për të zëvendësuar receptorin membranor të lidhur [³H] -spiperone. Sinjalet e receptorit të lidhur me membranën u llogaritën duke zbritur vlerat e receptorëve brenda qelizës nga vlerat totale të receptorit të shprehur. Qelizat u filtruan në një filtër GF / B (Millipore) dhe lanë herë 3 me lëngun e larjes (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrat u thanë dhe radioaktiviteti i mbetur u matur duke përdorur një kundërsulm likuidësh [24].

Përgatitja e membranës së celularit

Qelizat konfluente në 100 mm kultura-enët pas transfekcionit u lanë me PBS me akull të ftohtë dhe u korrnuan në 1 mL HME tampon (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Lysatet homogjenizuara u centrifuguan me 500 × g për 15 min dhe supernatuesit u centrifuguan më pas me 36,000 × g për 30 min. Pelletet të ri-pezullohen në tampon HME janë përdorur për analiza.

[³⁵S] -GTP_γS Lidhja e detyrueshme

Frakcionet e membranës së qelizës ishin para-inkubuar me 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) në tampon test (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA dhe 0.01 mM PBB) për 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) u shtua në përqendrimin përfundimtar të 3 nM në 30 μL dhe inkubohej më tej për 90 min. 170 μL e tamponit akull-ftohës (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, dhe 0.1 mM GTP) është shtuar për të ndaluar reagimin. Membruanët u filtruan në një filtër GF / B (Millipore) dhe lanë 3 herë me tampon larjeje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrat u thanë dhe radioaktiviteti u mat duke përdorur kundërsulm scintillation [25], [26].

Analiza Radioligand Lidhja

Membranat qelizore të përgatitura u inkubuan me 0.01 nM [³(565, pH 102), 30 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membruanët u filtruan në një filtër GF / B (Millipore) dhe lanë 3 herë me tampon larjeje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reagimi u ndërpre nga filtrimi i shpejtë përmes filtrave GF / C. Radioaktiviteti i mbetur është matur duke përdorur një kundërsulm të lëngëzuar [27]-[29].

cAMP Immunoassay enzimë

Transmetuar qelizat HEK 293 u trajtuan me 10 μM rolipram (R6520, Sigma) për 1 h, dhe pastaj trajtohen me forskolin 0.1 μM (F6886, Sigma) dhe përqendrimet në rritje të quinpirole (Q102, Sigma) për 30 min. Neuronet striatare të kultivuara primare u trajtuan me 10 μM rolipram për 1 h, dhe pastaj 1 μM dopamine për 1 h [22]. Lizatet e qelizave u përgatitën me 0.1 M HCl dhe nivelet e cAMP u zbuluan nga cAMP enzimë imunoassay kit (Sapphire Bioscience) sipas udhëzimeve të prodhuesit.

Neuroni striatal primar i kultivuar

Zona striatale u izolua nga truri embrional miut (E15). Indeksi i discizuar ishte i shkëputur në media minimal thelbësore (MEM) (11095, Invitrogen) që përmban 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) dhe 0.1% DNase I për 6 min në 37 ° C. Qelizat u ri-suspenduan në media plating (MEM me serum kali 0.01 M HEPES (pH 7.4) dhe 10% (vol / vol) (16050-122, GIBCO)). Neuronet u kultivuan për ditët 7 vitro (DIV 7) në MEM me shtojcën B27 (17504-044, Invitrogen) përpara se të aplikohet në imunoanalizat enzimatike cAMP.

Rezultatet

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 në ciklin e tretë intracelular të DRD2 vitro

Për të identifikuar substanca të reja Cdk5, kemi kryer një kërkim sistematik duke përdorur (S / T) PX (K / H / R) si sekuenca konsensus të njohjes Cdk5 [30] dhe identifikuan DRD2 si një substancë kandidate. Sekuenca e konsensusit, duke përfshirë serinë 321, gjendet në lakin e tretë intraqelizor të DRD2 (D2i3) ku janë përfshirë mekanizma të ndryshëm rregullues [3], [10], [11]. Sekuenca konservohet evolucionarisht në DRD2 në vertebrate, duke nënkuptuar një rëndësi funksionale të mbetjeve (Fig. 1A).

Shkarko:   

• PPT

  PowerPoint slide

• PNG

  imazh më i madh (2.08MB)

• TIFF

  imazhi origjinal (4.36MB)

Figura 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 në lak e tretë intracellular e DRD2 in vitro.

(A) Shtrirja e sekuencës së aminoacideve që tregon rajonet e ruajtura të DRD2 nga lloje të ndryshme (të shaded). Faqja e mundshme fosforilimi Cdk5 tregohet nga një yll. (B) i lidhur me IP vitro kinazës me proteina mutante të GST-D2i3 dhe GST-D2i3 rekombinante. Kompleksi Cdk5 / p35 i pasuruar nga ekstrakti i trurit të miut me anë të imunoprecipimit anti-p35 është përdorur për reaksionet e kinazës. Një autoradiograf i proteinave të fosforiluara është treguar së bashku me ngjyrën blu të shkëlqyeshme të Coomassie të të njëjtit xhel. Arrowhead tregon sinjal radioaktiv që korrespondon me GST-D2i3s dhe shigjeta e hapur tregon sinjale radioaktive nga p35. (C) spektri MS / MS i fragmentit të peptidës fosforiluar të D2i3. Modelet e fragmentimit teorik janë treguar më poshtë spektrit. Në mesin e të gjitha joneve të fragmenteve, y- dhe b-jonet e zbuluar janë të shënjuar në spektër. Y₆ dhe y₇ jonet tregojnë fuqishëm fosforilimin e serinës 321. (D) In vitro kinase me kompleksin e pastruar Cdk5 / GST-p25 duke përdorur proteina mutante GST-D2i3 dhe GST-D2i3. Proteinat e fosforilizuara u shfaqën në një autoradiograf, së bashku me ngjyrosjen e shkëlqyer Blue Coomassie. Shigjeta tregon sinjal radioaktiv që korrespondon me GST-D2i3 dhe shigjeta e hapur tregon sinjale radioaktive nga GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Për të vlerësuar kapacitetin e Cdk5 për fosforilizimin e D2i3, kemi kryer IP-të lidhura vitro kinazë duke përdorur një kompleks aktiv Cdk5 / p35 të pasuruar nga lizat e trurit të miut nga p35 imunoprecipitim me GST-D2i3 (amino acid residues 212-373) të rekombinuara si substrate. Ne kemi vërejtur sinjale fosforiluese në proteina GST-D2i3 dhe GST-D2i3 S297A të pastruar, por sinjali u zvogëlua ndjeshëm duke përdorur GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Për të verifikuar më tej fosforilimin e serinës 321 në GST-D2i3, kemi kryer analiza LC-MS / MS të mostrave nga IP-të lidhura vitro kinase duke përdorur LTQ XL spektrometri në masë. Në mënyrë konsistente, fosfo-peptidet që korrespondojnë me masën e peptideve 321 të fosfo-serinës u gjetën (Fig. 1C). Duke pasur parasysh se marrja e varur nga të dhënat gjatë analizës LC-MS / MS tenton të zbulojë proteina të bollshme në mostër [31], këto të dhëna sugjerojnë se mbetja e serinës 321 është vendi dominues i fosforilimit të Cdk5 në rajonin D2i3. Për të provuar fosforilimin direkt të serinës 321 në GST-D2i3 nga Cdk5, vitro kinazës duke përdorur kompleksin e pastruar Cdk5 / GST-p25 me proteina GST-D2i3 të pastruar rekombinant. Ne identifikuam një sinjal të rëndësishëm fosforilimi në GST-D2i3 që mungonte në GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Të marra së bashku, këto rezultate tregojnë se mbetja D2i3 S321 është një objektiv preferencial për fosforilimin e ndërmjetësuar nga Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 në ciklin e tretë intracelular të DRD2 në qeliza

Për të identifikuar fosforilimin e serinës 321, kemi ngritur antitrupa specifikë për fosfo-serinën 321 (pS321). Mostrat nga IP-të lidhura vitro kinazës janë analizuar me Western blotting duke përdorur antitrupat anti-pS321. Blotët treguan një grup të dallueshëm në reaksionin e kinazës që varet nga GST-D2i3 (Fig. 2A). Për të verifikuar potencialin e fosforilimit të serinës 321 në DRD2 nga Cdk5 në qeliza, imunoprecipitat anti-GFP nga qelizat HEK 293 që shprehin DRD2-GFP dhe DRD2 S321A-GFP me ose pa HA-Cdk5 dhe p35 janë analizuar nga Western blotting duke përdorur anti-GFP dhe anti-pS321 antitrupa. Karakteristikat e sinjaleve të bandave të zhveshura nga antitrupi anti-GFP që njihen për shkak të glikozilimit të tepërt të DRD2 vërehen vetëm në prani të DRD2-GFP dhe antitrupat anti-pS321 zbuluan sinjale të ngjashme DRD2 vetëm me shprehjen Cdk5 / p35 coFig. 2B) [7]. Për të verifikuar më tej fosforilimin e serinës 321 nga Cdk5, u gjeneruan D2i3 (FLAG-D2i3) dhe forma mutante e D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 dhe FLAG-D2i3 S321A shprehur me ose pa HA-Cdk5 dhe p35 në qelizat HEK 293 janë analizuar nga një analizë e ndryshimit të lëvizjes së lëvizjes SDS-gel. Një zhvendosje e konsiderueshme e mobilitetit të varur nga Cdk5 është vërejtur për FLAG-D2i3, por jo për FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Ne gjithashtu vlerësuam nivelin e fosforilimit të DRD2 në Ser321 me stimulimin agonist. HEK 293 qelizat që shprehin kompleksin DRD2-GFP dhe Cdk5 / p35 u stimuluan nga quinpirole, dhe imunoprecipitatet anti-GFP nga lizat e qelizave u analizuan me blotting Western përdorur anti-GFP dhe anti-pS321 antitrupa. Ne kemi vërejtur se fosforilimi i DRD5 i ndërmjetësuar nga Cdk2 në Ser321 nuk ishte prekur nga stimulimi agonist, i cili duket i ndryshëm nga grumbullimi i fosforileve ndërmjet ndërmjetësve GRK dhe PKC (Fig. 2D) [32], [33]. Së bashku, këto rezultate tregojnë se Cdk5 mund të fosforilizojë mbetjen serine të 321 të DRD2 në mjedisin qelizor.

Shkarko:   

• PPT

  PowerPoint slide

• PNG

  imazh më i madh (1.92MB)

• TIFF

  imazhi origjinal (3.5MB)

Figura 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 në lak e tretë intracellular e DRD2 në qelizat.

Fosforilimi Cdk5-ndërmjetës i serinës 321 është analizuar duke përdorur antitrupat anti-pS321. (A) Mostrat nga IP-të lidhura vitro kinazës duke përdorur proteina GST-D2i3 janë analizuar nga blotting Western (WB) me antitrupa treguar. Arrowheads tregojnë GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP dhe DRD2 S321A-GFP u shpreh me ose pa HA-Cdk5 dhe p35 në qelizat HEK 293. Anti-GFP immunoprecipitates u analizuan nga Western blotting duke përdorur anti-GFP dhe anti-pS321 antitrupat. Bracket tregon sinjale DRD2 dhe arrowhead hapur tregon sinjale jo-specifike nga immunoprecipitates anti-GFP. '% input' është volumi% i lysatit total për një reagim IP. Sinjale endacionale Cdk5 sinjalizohen me yje. (C) Analiza e lëvizjes së lëvizjes së xhelit. HEK 293 qelizat transfektuar siç tregohet janë analizuar nga Western blotting. (D) Transplantuar HEK 293 qelizat u trajtuan me quinpirole dhe immunoprecipitates anti-GFP u analizuan me blotting Western me anti-GFP dhe anti-pS321 antitrupa. Shigjeta e hapur tregon sinjale jo specifike nga imunoprecipitatet e anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Kompleksi Cdk5 / p35 dhe DRD2 janë të lidhur fizikisht

Ne hetuam ndërveprimin fizik potencial midis kompleksit Cdk5 / p35 dhe DRD2 sepse shumë substrate Cdk5 janë të njohura të jenë fizikisht të lidhur me kompleksin Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Së pari, u krye eksperimenti i tërheqjes GST. Proteina e GST-D2i3 e ricombinuar e pastruar u inkubua me lizat e trurit të miut dhe precipitatet e tërheqjes së GST u analizuan për blotting Western. Siç tregohet në Fig. 3A, Cdk5 endogjene dhe p35 u identifikuan në precipitate tërheqëse, duke treguar një ndërveprim fizik midis DRD2 dhe kompleksit Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Për më tepër, HA-Cdk5 dhe p35 janë zbuluar në imunoprecipitatet anti-GFP nga lysatet e qelizave HEK 293 që shprehin DRD2-GFP dhe Cdk5 / p35 (Fig. 3B). Përveç kësaj, ne kemi kryer analiza imunocytochemical dhe vërejtur se DRD2-GFP, HA-Cdk5 dhe p35 tregojnë sinjale të rëndësishme bashkë-lokalizimi në zonën membranare të qelizave HEK 293 (Fig. 3C, panelet e sipërme). Ne gjithashtu hetuam bashkë lokalizimin e DRD2 dhe Cdk5 / p35 në kontekstin neuronal. Në mënyrë të vazhdueshme, DRD2-GFP gjithashtu tregoi një bashkë-lokalizim të rëndësishëm me Cdk5 dhe p35 endogjen në neuronet e kultivuar striatal (DIV7), duke mbështetur më tej lidhjet funksionale midis DRD2 dhe Cdk5 / p35 (Fig. 3C, panelet e poshtme). Rezultatet tregojnë se DRD2 dhe Cdk5 / p35 mund të formojnë një kompleks dhe kështu, mbështesin nocionin se DRD2 është një substancë fiziologjike e Cdk5.

Shkarko:   

• PPT

  PowerPoint slide

• PNG

  imazh më i madh (3.91MB)

• TIFF

  imazhi origjinal (5.35MB)

Figura 3. Cdk5 / p35 mund të formojë një kompleks me DRD2.

(A) test GST pull-down duke përdorur proteinë të pastruar rekombinant GST-D2i3 me ekstrakt të trurit të miut. Precipitimet e tërheqjes së GST u nënshtruan analizave Western Blotting. 'Bead' tregon precipitimin e pull-down pa proteina GST. (B) Imunoprecipitimi i kompleksit DRD2 dhe Cdk5 / p35. IP-ja e Anti-GFP nga lizatet nga qelizat e transfektuara u nënshtruan analizave Western blotting. Bracket tregon sinjale DRD2 dhe arrowhead hapur tregon sinjale jo-specifike nga immunoprecipitates anti-GFP. Një njollë e mbivendosur për inputet gjithashtu tregohet në të djathtë. (C) Analizat immunocytochemical të DRD2 dhe Cdk5 / p35. HEK 293 qelizat që shprehin DRD2-GFP dhe Cdk5 / p35 u njolluan me anti-Cdk5 dhe anti-p35 antitrupat (panelet e sipërme). DRD2-GFP u shpreh vetëm në neuronet striaturë të kultivuar dhe të ngjyrosur me anti-Cdk5 dhe anti-p35 antitrupat (panelet e poshtme). Hoechst u përdorën për bërthamën e bërthamës. Bar shkalla është 5 μm. Të gjitha imazhet janë marrë duke përdorur mikroskopi confocal (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosforilimi i DRD5 i ndërmjetësuar nga Cdk2 zbut aktivitetin e receptorit

Është raportuar se fosforilacioni modulon vetitë kritike të GPCR-ve të tilla si lidhja e proteinave G, internalizimi i receptorëve, lokalizimi intracellular dhe lidhja me proteinat e modulatorëve [9], [11], [24]. Njëinternalizimi i receptorit të induktuar nga goni është një proces kritik rregullues i transduksionit të sinjaleve. Ne hetuam modulimin e Cdk5-mediated të internalizimit DRD2. HEK 293 qelizat që shprehin DRD2-GFP dhe DRD2 S321A-GFP me ose pa Cdk5 / p35 u inkubuan me quinpirole 1 μM për të nxitur internalizimin e stimuluar me agonist DRD2 (Fig. 4A). [³H] -spiperone të qelizave që shprehin DRD2-GFP janë ulur ndjeshëm në trajtimin 30 min quinpirole dhe janë gjetur në 90 min. Interesante,³H] -spiperone të qelizave që shprehin DRD2-GFP dhe Cdk5 / p35 u reduktuan gjithashtu në trajtimin 30 min quinpirole por nuk u gjetën në 90 min (Fig. 4A, seksioni i dytë). Ne anen tjeter, [³H] -spiperone të qelizave shprehëse DRD2 S321A-GFP u reduktuan në 30 min dhe u gjetën në 90 min, pavarësisht nga bashkë-shprehja me Cdk5 / p35. Studimet e mëparshme kanë treguar se DRD2 i internuar riciklon mbrapa në membranën e plazmës pas stimulimit të zgjatur agonist [11]. Thus duket se fosforilimi i DRD5 i ndërmjetësuar nga Cdk2 është i përfshirë në proceset e resensitizimit pas internalizimit të DRD2 të agonistëve.

Shkarko:   

• PPT

  PowerPoint slide

• PNG

  imazh më i madh (387KB)

• TIFF

  imazhi origjinal (1.31MB)

Figura 4. Fosforilizimi i ndërmjetësuar nga Cdk5 zbut shprehjen e sipërfaqes DRD2 dhe sinjalizimin në drejtim të rrymës.

(A) shprehja e sipërfaqes DRD2 e matur nga [³H] -spepiperon detyrues. Transmetuar HEK293 qelizat u stimuluan me 1 μM quinpirole për kohën e treguar dhe korrur, e ndjekur nga 3 nM [³Trajtimi H] -spiperon për 3 orë. Radioaktiviteti u mat dhe sinjalet sipërfaqësore u llogaritën. Shiritat e gabimeve paraqesin mesataren ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA njëkahëshe me testin post hoc të Dunnett: krahasoni të gjitha kolonat kundrejt kolonës së kontrollit). (B) [³⁵S] -GTP_γS test i detyrueshëm. Membranat e qelizës u përgatitën nga qelizat e transfektuara siç tregohet. Përgatitjet e membranës u inkubuan me 1 μM quinpirole të ndjekur nga 3 nM [³⁵S] -GTP_γS për 90 min. Shiritat e gabimeve paraqesin mesataren ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA njëkahëshe me testin Bonferroni post hoc: krahasoni të gjitha çiftet e kolonave). (C) Quinpirole-konkurruese [³H] -spepiperon detyrues. Përgatitjet e membranës nga qelizat e transfektuara u inkubuan me 0.01 nM [³H] -spiperon dhe përqendrimet në rritje të kinpirolit për 30 min. Regresioni jo-linear u mor nga GraphPad. Shiritat e gabimeve tregojnë mesataren ± SE (n = 3). Imuno-analizat e enzimës CAMP në qelizat HEK 293 të transfektuara. Qelizat e transfertuara u trajtuan paraprakisht me 10 μM rolipram për 1 orë, dhe më pas u trajtuan bashkë me 0.1 μM forskolin dhe duke rritur përqendrimet e quinpirole për 30 min. Regresioni jo-linear u mor nga GraphPad. Shiritat e gabimeve paraqesin mesataren ± SE (n = 4; ** p <0.01; dy bishta t-tests). (E) Neuronet striaturë të kultivuara nga lloji i egër dhe embrionet e p35 (DIV 7) u trajtuan me 10 μM rolipram për 1 h pasuar nga 1 μM dopamine për 1 h. Bare gabimi përfaqësojnë mesataren ± SE (n = 4; **p<0.01; me dy bishta t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Ne vlerësuam më tej një ndryshim të mundshëm të lidhjes së proteinave G të stimuluar me agonist ndaj DRD2 të lidhur me fosforilimin e ndërmjetësuar me Cdk5 duke përdorur [³⁵S] -GTP_γS test i detyrueshëm [25], [26]. DRD2-GFP dhe DRD2 S321A-GFP me ose pa Cdk5 / p35 janë shprehur në qelizat HEK 293. Membranat janë përgatitur dhe stimuluar me quinpirole 1 μM dhe lejohen më tej [³⁵S] -GTP_γS inkorporimi. DRD2-GFP dhe Cdk5 / p35 që shprehin membranën qelizore treguan dukshëm të dëmtuar [³⁵S] -GTP_γS në krahasim me të gjitha membranat e tjera qelizore (Fig. 4B). Këto rezultate tregojnë se fosforilimi i ndërmjetësuar nga Cdk5 poshtë-rregullon proteina G të stimuluar agonistë në DRD2.

Përveç kësaj, quinpirole-konkurrojnë [³H] -spepiperone janë kryer për të hetuar çdo ndryshim të mundshëm në afinitet agonist në DRD2 nga fosforilimi i ndërmjetësuar nga Cdk5. Lidhja konkurruese e [³H] -spiperone pas trajtimit të përqendrimeve në rritje të quinpirolit në përgatitjen e membranës nga transfektuar u mat. Konkurrenca e detyrueshme e quinpirole dhe [³H] -spiperone në DRD2-GFP dhe DRD2 S321A-GFP bëri logK të ngjashëm_i (-9.789 për DRD2-GFP; -9.691 për DRD2 S321A-GFP), duke treguar se afiniteti i ligandit ndaj DRD2 nuk ndikohet ndjeshëm nga fosforilimi i ndërmjetësuar nga Cdk5 në DRD2 (Fig. 4C).

Phosphorylation mediated Cdk5 Down-rregullon rrugën e sinjalizimit DRD2-cAMP

Tjetra, ne hetuam nëse modifikimi i DRD2 nga Cdk5 ndikon në rrugët e sinjalizimit në rrjedhën e sipërme. Ne monitoruam ndalimin e ndërmjetësuar nga DRD2 për prodhimin e cAMP të stimuluar me forskolin nga adenilil ciklaza në qelizat që shprehin DRD2-GFP dhe DRD2 S321A-GFP duke përdorur imunoanalizën enzimatike cAMP. Qelizat që shprehin DRD2 treguan nivele të ulëta të cAMP në përgjigje të quinpirol në një mënyrë të varur nga dozë. Veçanërisht, bashkë-shprehja e Cdk5 / p35 uli ndjeshëm pengimin maksimal të formimit të cAMP (Fig. 4D, paneli i majtë). Nga ana tjetër, në qelizat shprehëse DRD2 S321A-GFP, formacionet e cAMP u frenuan në mënyrë efektive në përgjigje të trajtimit të quinpirol pa marrë parasysh shprehjen e Cdk5 / p35 (Fig. 4D, paneli i djathtë). Këto rezultate tregojnë se fosforilimi i DRD5 i ndërmjetësuar nga Cdk2 zbut veprimtarinë frenuese të DRD2 në rrugën e sinjalizimit të cAMP-it në drejtim të rrymës. Për të konfirmuar më tej fenomenet në një mjedis më të përshtatshëm fiziologjik, ne përdorëm neuronet primare të kultivuara nga embrione të thyera të mangëta në p35, një aktivator thelbësor Cdk5. Neuronet striatare të kultivuara primare u trajtuan me dopamine të 1 μM dhe u analizuan nga imunoanalizmi i enzimës cAMP. Neuronet nga p35 minjtë e zhdukur ekspozuan nivelet e zvogëluara të cAMP në krahasim me neuronet e tipit të egër kur stimuloheshin me dopamin (Fig. 4E). TAken së bashku, ne konkluduam se fosforilimi i DRD5 i ndërmjetësuar nga Cdk2 rezulton në një ulje të tonit frenues në rrugën e cAMP të ushtruar nga DRD2.

Diskutim

Ne identifikuam DRD2 si një substancë novelë të Cdk5. Fosforilizimi duket se ul-rregullon shprehjen e sipërfaqes së DRD2 duke ndikuar në fatin e DRD2 duke ndjekur internalizimin e receptorit duke zvogëluar DRD2 G_i-çiftimi dhe rruga e poshtëm e cAMP. Meqë mbetjet fosforiluese S321 ekzistojnë si në DRD2 të gjatë dhe të shkurtër, isoformet, mekanizmi i propozuar në këtë studim mund të jetë një mënyrë e përgjithshme rregullimi në sinjalizimin e ndërmjetësuar nga DRD2.

DRD2 në neuronet e mesme me gjemba nuk është konsideruar vetëm si një tip i madh i receptorit dopamin, por është njohur gjithashtu për ndjeshmërinë e tij ndaj ndryshimeve në disponueshmëri në përgjigje të stimujve mjedisorë. Desensitizimi dhe resensitizimi i DRD2 i agonistit janë studiuar gjerësisht [11], [24]. Në veçanti, një numër studimesh kanë treguar se efektet e ekspozimit kronik psikostimulues, të tilla si kokaina dhe amfetamina, të cilat rrisin nivelin extracellular të dopaminës në synapse striatal, janë të shoqëruara me ndryshime dinamike të DRD2 postsynaptically [36]. Në të vërtetë, përdoruesit kronikë të kokainës njihen se kanë nivele të reduktuara të DRD2 në zonën striatale dhe disponueshmëria e DRD2 në bërthamë accumbens (NAcc) tregon një korrelacion negativ me sjelljet e kërkimit të drogës dhe përforcimit në minj dhe primat [37]-[39]. Këto rezultate tregojnë se funksionaliteti i DRD2 është shumë i ndjeshëm ndaj rregullimit adaptiv ose kompensues në përgjigje të stimujve të ndryshëm duke përfshirë ekspozimin kronik të drogës. Rezultatet tona tregojnë se mbetja S321 në lakin e tretë intracellular të DRD2 mund të phosphorylated nga Cdk5, e cila rezulton në një ulje të ndikimit frenues të DRD2 në rrugë cAMP. Ky ndërveprim propozon një mekanizëm të ri rregullator të lidhur me Cdk5 në neuronet dopaaminoceptive që mund të lidhen me natyrën dinamike të disponueshmërisë sipërfaqësore të DRD2.

Duhet të theksohet se Cdk5 është i njohur të jetë një komponent kyç në ndërmjetësimin e ndryshimeve adaptive të mjedisit nervor. Për shembull, ndryshimet strukturore dhe funksionale të spines dendritike në neuronet e qarkut limbik janë një nga pasojat e ekspozimit të përsëritur psikostimulues [40]. Këto ndryshime shoqërohen nga ndryshime të ndryshme molekulare duke përfshirë indukimin e proteinës lidhëse të reagimit të reagimit cAMP (CREB) dhe ΔFosB, faktorët e transkriptimit që shfaqin një rregullim të qëndrueshëm në përgjigje të administrimit kronik të kokainës [41], [42]. E rëndësishmja, Cdk5 është një objektiv i ΔFosB [19], dhe shumë komponentë kritikë të përfshirë në dinamikën e shpinës dendriti, si PSD-95, kinaza të aktivizuara p21 (AKP), β-catenin dhe spinophilin, u raportuan si substrate Cdk5 [43]-[46]. Në mënyrë konsistente, manipulimet gjenetike ose farmakologjike të aktivitetit Cdk5 shkakton ndryshime në morfologjinë e shtyllës së dendritit dhe reagimet e sjelljes ndaj kokainës, duke nënkuptuar role kritike për Cdk5 në ndryshimet molekulare dhe morfologjike të qarqeve mesolimbike të dopaminës [47], [48]. Rezultatet tona që tregojnë se DRD2 është një objektiv novelë i Cdk5 siguron një pasqyrë shtesë në ndryshimet adaptive të sistemit dopamin në përgjigje të ekspozimeve kronike të drogës për shkak të rregullimit të mëvonshëm të ΔFosB të ndërmjetëm të Cdk5 mund të nxisë një rritje tonike në fosforilimin e DRD2 . Për më tepër, DRD2 është i njohur për të ndikuar në procese të shumta qelizore, duke përfshirë rregullimin e rrugëve të cAMP dhe MAP kinazës dhe ngjarjet transcriptional në rrjedhën e poshtme [42], [49]. Kështu, gjetjet në këtë studim mund të përshkruajnë jo vetëm një rregullim të drejtpërdrejtë të DRD2 nga Cdk5 por gjithashtu ofrojnë një pasqyrë të re në përgjigjet adaptive të sistemit dopamin ndaj ekspozimit kronik të drogës.

Kontributet e autorëve

Konceptuar dhe projektuar eksperimentet: JJ YUP DH SKP. Kryen eksperimentet: JJ YUP DKK YK. Analizuar të dhënat: JJ YUP DKK SL YK SAL HL VSG DH SKP. Reagente / materialet e analizuara / mjetet e analizës: YHS. Shkroi letër: JJ SKP.