Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Botuar në internet 2017 Maj 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstrakt
Qëllimet / hipotezë
Zmadhimi i yndyrave dietik shkakton obezitet tek njerëzit dhe brejtësit. Studimet e fundit në njerëz dhe brejtës kanë treguar se varësia ndaj yndyrave ndan një mekanizëm të përbashkët me varësinë ndaj alkoolit, nikotinës dhe narkotikëve sa i përket një mosfunksionimi të sistemeve shpërblimesh të trurit. Është theksuar se një dietë me yndyrë të lartë (HFD) zvogëlon sinjalizimin e receptorit dopamin D2 (D2R) në striatumin, një rregullator kryesor i sistemit të shpërblimit të trurit, duke rezultuar në mbarime hedonike. Ne kemi raportuar më parë se përbërësi bioaktive γ-oryzanol me ngjyrë kafe të ngushtë ka zbutur preferencën për një HFD nëpërmjet kontrollit hipotalamik. Prandaj kemi hulumtuar mundësinë që γ-oryzanol do të modulojë funksionimin e sistemit të shpërblimit të trurit në minj.
Metodat
Meshkujt C57BL / 6J të ushqyerit me HFD u trajtuan me gojë me γ-oryzanol dhe u vlerësuan nivelet striatum të molekulave të përfshira në sinjalizimin D2R. Ndikimi i γ-oryzanol në metilation ADN e promotor D2R dhe ndryshimet e mëvonshme në preferencat për yndyrë diete u shqyrtuar. Përveç kësaj, u hetuan efektet e 5-aza-2'-deoksicitidine, një inhibitor i fuqishëm i ADN-së metiltransferazës (DNMTs), mbi preferencën e ushqimit, sinjalizimi D2R dhe nivelet e DNMTs në striatum. Efektet frenuese të γ-orzzanolit në aktivitetin e DNMTs u vlerësuan enzimatikisht në vitro.
Rezultatet
Në striatum nga minjtë ushqyer një HFD, prodhimi i D2Rs u zvogëlohet nëpërmjet një rritje të methylation ADN e rajonit promotor i D2R. Administrimi oral i γ-oryzanol uli shprehjen dhe aktivitetin e DNMTs, duke rivendosur nivelin e D2Rs në striatum. Ndalimi farmakologjik i DNMTs nga 5-aza-2'-deoksicitidin gjithashtu përmirësoi preferencën për yndyrën dietike. Në përputhje me këto rezultate, testet enzimatike in vitro treguan se γ-oryzanol frenoi aktivitetin e DNMTs.
Përfundime / interpretim
Ne kemi demonstruar se γ-oryzanol përmirëson hypermethylation të ADN-së të nxitur nga HFD e rajonit të promotorit të D2R në striatumin e minjve. Paradigma jonë eksperimentale nxjerr në pah γ-oryzanol si një substancë premtuese antiobesiteti me pronën e dallueshme të të qënit një modulator epigenetik i ri.
Materiale plotësuese elektronike
Versioni online i këtij artikulli (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) përmban material shtesë shtesë të shqyrtuar, por të paautorizuar, i cili është në dispozicion të përdoruesve të autorizuar.
Prezantimi
Zmadhimi i personave të trashë ndan, të paktën pjesërisht, mekanizma të zakonshëm me varësi ndaj alkoolit, nikotinës dhe narkotikëve [1]. Sikurse rregullimi hipotalamik dhe hormonal i oreksit, sistemi i shpërblimit të trurit, sidomos sinjalizimi i receptorit dopamin, është i lidhur ngushtë me sjelljen e të ushqyerit me anë të varësisë [2]. Një studim i mëparshëm në rats tregoi se ulja e receptorit striatal dopamine D2 (D2R) nga ARN interferuese me flokë të shkurtër të ndërmjetësuar nga lentivirusi nxiti me shpejtësi deficitet e shpërblimeve të ngjashme me varësinë dhe kërkimin e ushqimit të detyruar [3]. Për shkak të reduktimit të densitetit D2R, striatum dorsal është më pak i përgjegjshëm ndaj shpërblimit të ushqimit krahasuar me grupet e kontrollit të ligët në njerëz të trashë dhe brejtës [3-5]. Në përputhje me këtë nocion, TaqIA allele e ANKK1 lokacioni i gjenit (kodimi i DRD2 / përsëritjes së anketës dhe domeni i kinazës që përmban 1), i cili zvogëlon prodhimin striatal D2R, është i lidhur me një fenotip të trashë tek njerëzit [6], ndërsa efektet e humbjes së peshës pas operacionit bariatric janë të lidhura me dendësi të ngritur striatal D2R [7]. Këto të dhëna sugjerojnë fuqishëm rëndësinë e D2R striatal si një objektiv i ri terapeutik për trajtimin e obezitetit. Sidoqoftë, disa ilaçe që janë zhvilluar që kanë vepruar në sistemin e shpërblimit të trurit kanë shkaktuar efekte të konsiderueshme negative, duke përfshirë probleme serioze psikiatrike, duke rezultuar në tërheqjen eventuale të tyre nga klinikat [8].
Modifikimet epigenetike janë kritike jo vetëm për zhvillim dhe diferencim, por edhe për shkak se ato krijohen si rezultat i ndryshimeve mjedisore, duke përfshirë dietën dhe stilin e jetës [9]. Metilizimi i ADN-së është një ngjarje epigjenetike kryesore për stabilitetin e shprehjes së gjeneve [9]. Në rats, ekspozimi i nënës në një dietë me yndyrë të lartë (HFD) ndërgjeneron ndërthurjen e metilimit të ADN-së brenda sistemit qendror të shpërblimit në pasardhës, duke çuar në tejkalimin e HFD nga pups [10]. Në veçanti, metiltransferat e ADN (DNMTs) luajnë role kritike në rregullimin e sjelljes së ushqyerjes dhe aktivitetit fizik [10, 11], duke sugjeruar që DNMTs mund të premtonin objektiva terapeutike për terapinë e sindromës së diabetit të trashje. E rëndësishmja, disa substanca natyrore që rrjedhin nga ushqimi, duke përfshirë acidin kafeik dhe epigallocatechin, njihen që veprojnë si frenues të DNMT [12, 13].
Kohët e fundit kemi treguar se komponenta γ-oryzanol, oriz i ngushtë me ngjyrë kafe, një përzierje e esterit të acidit ferulik dhe disa phytosterols, zbut preferencën për yndyrën dietike nëpërmjet një rënie të stresit të retikulumit endoplazmatik (ER) hypothalamic [14]. Në minj dhe lepujt, orga-nenti γ-oryzanol, i orarizuar u absorboi me shpejtësi nga zorrët dhe shpërndahej kryesisht në tru [15, 16]. Duke marrë këto gjetje së bashku, produktet natyrore që rrjedhin nga ushqimi që veprojnë në sistemin nervor qendror mund të jenë një alternativë për të përmirësuar sigurinë në sjelljen e ushqyerjes së dobësuar në obezitet. Në këtë kontekst, ne kemi testuar hipotezën se γ-oryzanol do të ndryshojë statusin e metilation ADN në sistemin e shpërblimit të trurit, duke rezultuar në një zbutje të preferencës për një HFD në minj.
Metodat
kafshët
Minjtë shtatë javë C57BL / 6J meshkuj të marrë nga Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japoni) u strehuan (3-4 për kafaz) në kushte specifike pa patogjen në 24 ° C nën një dritë 12 orë / 12 orë / cikli i erret Pas një jave aklimatizimi, minjtë 8-vjeçarë u përputhën me peshën dhe u ndanë në dy ose tre grupe për t'iu nënshtruar secilit eksperiment. Minjve u lejohej hyrja falas në ushqim dhe ujë. Të gjitha eksperimentet me kafshë u miratuan nga Komiteti i Etikës së Eksperimenteve të Kafshëve të Universitetit të Ryukyus (Nr. 5352, 5718 dhe 5943).
Administrimi i γ-oryzanol dhe 5-aza-2'-deoksicitidine
Për të vlerësuar preferencën për HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japoni) u administrua në minj 8-javë nga gavage gjatë testit të zgjedhjes ushqimore siç përshkruhet më parë [14, 17]. Për eksperimentet e tjera, një HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, SHBA) që përmban 0.4% γ-oryzanol u prodhua si fishekë. Komponentët e dietës janë paraqitur në materialin elektronik suplementar (ESM) Tabela 1. Pas 12 javësh të ushqyerit, indet u mblodhën nga striatumi dhe hipotalamusi. Marrja ditore e γ-orzanolit, e vlerësuar nga marrja mesatare e ushqimit të minjve, ishte afërsisht 320 μg / g peshë trupore. Dozat e γ-orzanolit u përcaktuan siç u përshkrua më parë [14] 5-aza-2′-deoksicitidina (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) u injektua në mënyrë intraperitoneale (0.25 μg / g peshë trupore) tri herë në javë për 12 javë [18].
Vlerësimi i preferencës për yndyrën dietike
Për të vlerësuar preferencat për yndyrën dietike, testet ushqimore ofruan një zgjedhje midis chow dhe HFD (D12450B dhe D12451; Diets Research) siç përshkruhet më parë [14]. Komponentët e dietës janë paraqitur në tabelën ESM 1. Shkurtimisht, minjve u lejohej hyrja e lirë në chow dhe HFD. Marrjet e chow dhe HFD u matën çdo javë dhe u analizuan për ndryshimet në preferencën për yndyrën dietike. Preferenca e HFD është llogaritur sipas formulës: Preferenca e HFD = [(marrja e HFD / marrja totale e ushqimit) × 100].
Sekuenca bisulfite për metilimin e ADN-së
ADN-ja u pastrua duke përdorur një DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japoni). Solucioni i ADN-së u përzie me 3 mol / l NaOH të sapo përgatitur, u inkubatua në 37 ° C për 15 min dhe u shtua në 5.3 mol / l ure, 1.7 mol / l bisulfit natriumi dhe 4.9 mmol / l hidrokinon. Tretësira iu nënshtrua 15 cikleve të denatyrimit në 95 ° C për 30 s dhe inkubacionit në 50 ° C për 15 min [19]. ADN-ja e trajtuar me bisulfit u pastrua duke përdorur MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) dhe u amplifikua me PCR duke përdorur një KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, SHBA) dhe primers rreth faqes CpG të rajonit të promotorit të D2R . Sekuencat e abetares ishin si më poshtë: primer përpara, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; primer i kundërt, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Tjetra, sekuencat përshtatëse u shtuan dhe u pastruan duke përdorur Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, SHBA). Mostrat pastaj u grumbulluan dhe ngarkuan në një GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japoni) për sekuenca sipas protokollit të prodhuesit. Niveli i metilimit u shpreh si përqindja e citozinave të metiluara në të gjitha mbetjet e citozinave.
Analiza e aktivitetit të DNMT
Përcaktimi i aktivitetit enzimatik të DNMT është kryer duke përdorur një metodë EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibitory Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) dhe kit EPIgeneous Methyltransferase Assay (Cisbio Japan, Chiba, Japoni) sipas protokolleve të prodhuesit.
Për të vlerësuar aktivitetin frenues të secilës përbërje në methylation DNA, formimi i S-adenozil-l-homocisteinë (SAH) u mat në prani të secilës përbërje (20 μmol / l për analizat e shqyrtimit), S-amionin -adenozil (SAM; 10 μmol / l) dhe substrat DNMT (4 ng / μl) në 37 ° C për 90 min. Për të vlerësuar kinetikën Michaelis – Menten, DNMT1 (20 μmol / l) u inkubatua me γ-orizanol, SAM (5 μmol / l) dhe përqendrimin e treguar të poli dI-dC në 37 ° C për 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) dhe DNMT3b (100 μmol / l) u inkubuan me γ-orizanol, SAM (5 μmol / l) dhe përqendrimin e treguar të polig dG · dC në 37 ° C për 120 min. Analizat u kryen në katërfish. Proteina e ekstraktuar (0.75 mg / ml) është inkubuar me SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (5 μg / ml) dhe poli dG · dC (5 μg / ml) në 40 ° C për 120 min, dhe U formua formimi i SAH.
Përcaktimi i aktivitetit të receptorit-γ të lidhur me estrogjenin
Aktiviteti i mundshëm antagonist i γ-orizanolit në receptorin-γ të lidhur me estrogjenin (ERRγ) u vlerësua duke përdorur Sistemin e Vlerësimit të Raportuesit Gama të receptorit të lidhur me estrogjenin njerëzor (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) sipas protokollit të prodhuesit. Shkurtimisht, qelizat raportuese të gjitarëve jo-njerëzorë që shprehin ERRγ aktiv ishin ekspozuar ndaj përqendrimeve të treguara të secilës përbërje për 24 orë në tre kopje.
Western blotting
Kjo është kryer siç përshkruhet më parë [20] me antitrupa kundër D2R (1: 500, lepuri), transportues dopamine (DAT; 1: 500, lepuri), hidroksilaza e tirosinës (TH; 1: 1000, lepuri) (AB5084P, AB1591P dhe AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, SH.B.A.), dhënësi i sinjalit dhe aktivizuesi i transkriptimit 3α (STAT3α; 1: 1000, lepuri), DNMT1 (1: 1000, lepuri), DNMT3a (1: 1000, lepuri) (nr. 8768, 5032 dhe 3598; Teknologjia e sinjalizimit qelizor, Tokio, Japoni), DNMT3b (1 μg / ml, lepuri), ERRγ (1: 1000, lepuri) dhe β-aktin (1: 10,000, miu) (ab16049, ab128930 dhe ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
PCR sasiore në kohë reale
Shprehja e gjeneve është ekzaminuar siç përshkruhet më parë [14]. nivelet e ARNi u normalizuan në Rn18s (18S rRNA). Përcaktuesit e abetare të përdorura për analizat sasiore në kohë reale të PCR janë përmbledhur në tabelën ESM 2.
Analiza statistikore
Të dhënat shprehen si mesatare. SEM. ANOVA me një drejtim dhe ANOVA me masa të përsëritura të ndjekura nga teste të krahasimit të shumëfishtë (metoda Bonferroni – Dunn) u përdorën aty ku ishte e zbatueshme. Të studentëve t test u përdor për të analizuar dallimet midis dy grupeve. Dallimet u konsideruan të rëndësishme në p <0.05.
Rezultatet
Ndalimi farmakologjik i DNMTs nga 5-aza-dC zbut preferencën për yndyrën dietike në minj
Në minj ushqyer HFD, metilation ADN në rajonin e promotor i D2R në striatum ishte rritur në mënyrë të konsiderueshme në krahasim me minj ushqyer një dietë chow (Fig. (Fig.1a) .1a). Nga ana tjetër, methylation hypothalamic ADN në rajonin e promotorit të D2R ishte dukshëm më e lartë se ajo në striatum nën një dietë chow (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) dhe nuk u ndryshua nga HFD (Fig. (Fig.1f) .1f). Në minj ushqyer HFD, methylation shtuar ADN në rajonin e promotorit të D2R në striatum u normalizua nga trajtimi me 5-aza-dC, një frenues i fuqishëm DNMT (Fig. (Fig.1a) .1a). Në të kundërt, metilimi i ADN në rajonin e promotorit të D2R në hypothalamus nuk u ndryshua ndjeshëm nga trajtimi me 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f) Në striatumin e minjve meshkuj 20-javësh të ushqyer me HFD për 12 javë, nivelet e mRNA dhe proteinave të D2R u ulën ndjeshëm (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Në të kundërt, nivelet e receptorëve D1 dopamine (D1Rs, koduar nga Drd1), të cilat veprojnë në mënyrë të kundërt me D2Rs në adenyllyl cyclase dhe sinjalizimi intracellular ndërmjetësuar nga cAMP, ishin të pandryshuara (Fig. (Fig.1c) .1c). Për më tepër, nuk kishte asnjë ndryshim në nivelet e molekulave të tjera që lidhen me sinjalizimin D2R, të tilla si TH dhe DAT në nivelin e ARNi dhe / ose proteinës (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Nga ana tjetër, në hypothalamus nuk u vërejtën ndryshime të dukshme, përfshirë edhe për D2R (Fig. (Fig.1g-m) .1g-m). Veçanërisht, nivelet e proteinave të D2R dhe TH në hypothalamus ishin shumë më të ulëta se ato në striatum (Fig. (Fig.1l, 1l, m), duke reflektuar ndoshta rëndësinë relative të sinjalizimit të receptorit dopamin në sistemin e shpërblimit të trurit krahasuar me hipotalamusin.
Për të ekzaminuar nëse metilimi i ADN-së në rajonin e promotorit të D2R do të ndryshonte preferencën për yndyrën dietike, u analizua sjellja e ushqyerjes së minjve të trajtuar me 5-aza-dC. Siç pritej, 5-aza-dC rritur dukshëm mRNA dhe nivelet e proteinave për D2R në striatumin e minjve të ushqyer me HFD (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Nga ana tjetër, nuk kishte asnjë efekt në nivelet e Drd1, Th Slc6a3 (encoding DAT) në striatum, ose në nivelet e Drd2, Drd1, Th Slc6a3 në hypothalamus (Fig. (Fig.1c-e, 1c-e, g-m). Ndërsa minjtë e trajtuar me automjete preferonin HFD, preferenca për HFD ishte ulur ndjeshëm në minj të trajtuara me 5-aza-dC (88% e vlerave për minjtë e trajtuar nga mjetet) (Fig. (Fig.1n) .1n). Si pasojë, trajtimi me 5-aza-dC ka zvogëluar fitimin në peshën e trupit (Fig. (Fig.11o).
γ-oryzanol zvogëlon nivelet e DNMTs në striatum të minj HFD-ushqyer
Siç kemi raportuar më parë [14], administrimi oral i γ-oryzanol tek minjtë meshkuj nga gavage zvogëloi ndjeshëm preferencën për një HFD (93% e vlerave për minj të trajtuara nga automjeti) (Fig. (Fig.2a) 2a), duke rezultuar në një zbutje të dukshme të shtimit të peshës trupore (Fig. (Fig.2b) .2b). Prandaj kemi hulumtuar ndikimin e mundshëm të γ-oryzanol në modulimin epigenetik të D2Rs në striatum.
Në gjitarë, ekzistojnë tre DNMT-të kryesore - DNMT1, 3a dhe 3b. DNMT1 funksionon për të mbajtur methylation DNA, ndërsa DNMT3a dhe 3b luajnë një rol në lehtësimin e methylation de novo DNA [21]. Për të shqyrtuar ndikimin e mundshëm të γ-oryzanol në DNMTs in vivo, ne vlerësuam nivelet e DNMTs në trurin e minjve të ushqyer me HFD. Megjithëse HFD në vetvete nuk kishte efekt mbi mRNA dhe nivelet e proteinave të DNMTs ose në striatum ose hypothalamus, plotësim me γ-oryzanol ulur ndjeshëm nivelet e DNMTs në striatum, por jo në hypothalamus (Fig. (Fig.2c-e, 2c-e, g-i, k-n). Këto të dhëna ngrenë mundësinë që γ-oryzanol mund të rregullojë nivelet e DNMTs në një mënyrë të veçantë striatum. Në mënyrë të ngjashme, 5-aza-dC zvogëloi në mënyrë të konsiderueshme nivelet e mRNA-së të DNMT3a dhe 3b preferenciale në striatum (ESM Fig. 1a-d).
Në bazë të një studimi të mëparshëm që tregoi se niveli i ARNi i DNMT1 ishte rregulluar pozitivisht, të paktën pjesërisht, nga receptori bërthamor ERRγ [22], ne shqyrtuam efektin e mundshëm të γ-oryzanol në aktivitetin ERRγ. Në qelizat jo-njerëzore të gjitarëve që shprehimisht shprehin ERRγ aktive, 4-hidroksi tamoxifen, një agonist i fuqishëm i anasjelltë i ERRγ, uli dukshëm aktivitetin ERRγ. Nga vini re, γ-oryzanol ulur pjesërisht aktivitetin ERRγ (një reduktim afërsisht 40% e vlerës së lindur) (Fig. (Fig.3a) .3a). E rëndësishmja, ERRγ u shpreh shumë në striatum, por jo në hypothalamus (Fig. (Fig.3b-d) .3b-d). Në kundërshtim me situatën për striatum, γ-oryzanol rritur dukshëm nivelet e proteinave të DNMT1 vetëm në hypothalamus (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Këto rezultate mund të shpjegohen, të paktën pjesërisht, duke gjetur se STAT3α, një rregullator pozitiv i nivelit DNMT1 [23], u shprehur me bollëk në hypothalamus, por jo në striatum (Fig. (Fig.33e-g).
Për të vlerësuar më tej ndikimin e γ-oryzanol në aktivitetin e DNMTs in vivo, formimi i SAH, një nënprodukt i methylation ADN dhe gjithashtu një frenues i fuqishëm i DNMTs, u vlerësua në minj të trajtuara γ-oryzanol ushqyer HFD. Nuk kishte ndryshime të rëndësishme në formimin SAH në as striatum ose hypothalamus në mes HFD-ushqyer dhe chow-ushqyer minj (Fig. (Fig.2f, 2f, j). Dukshëm, γ-oryzanol ulur ndjeshëm SAH formimin në striatum (Fig. (Fig.2f) 2f), por jo në hypothalamus (Fig. (Fig.2j) 2j), duke sugjeruar që γ-oryzanol mund të shtypë aktivitetin e DNMTs në një mënyrë të veçantë striatum në minj ushqyer HFD.
Analizat enzimatike mbi vetitë frenuese të γ-oryzanol për DNMTs in vitro
Ne vlerësuam më pas ndikimin e γ-oryzanol në aktivitetin e DNMTs in vitro. U vlerësuan potencialet frenuese të γ-oryzanol, acidit ferulik, 5-aza-dC, haloperidol (një përfaqësues D2R antagonist), quinpirole (një agonist përfaqësues D2R) dhe SAH kundër DNMTs. Si një kontroll pozitiv, SAH ka attenuated strongly aktivitetet e DNMTs në një mënyrë të varur nga dozë (Fig. (Fig.4a-f) .4a-f). Siç pritej, haloperidol dhe quinpirole nuk treguan efekt mbi aktivitetet e DNMTs (ESM Fig. 2). Vërejtshëm, γ-oryzanol frenoi në mënyrë të konsiderueshme aktivitetet e DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) dhe 3b (frenimi maksimal 57%) (Fig. (Fig.4d-f) .4d-f). Në të kundërt, aktiviteti frenues i acidit ferulic, një metabolit i γ-oryzanol, ishte shumë më i ulët se ai i γ-oryzanol (Fig. (Fig.44d-f).
Ne kemi studiuar më tej pronat frenuese të γ-oryzanol në DNMTs. Formimi i SAH ishte matur për të vlerësuar aktivitetin frenues të γ-oryzanol në DNMTs in vitro. Të dhënat mbi formimin e SAH gjatë metilimit të ADN-së të ndërmjetësuar nga DNMT tregojnë një model të saturueshëm të kinetikës Michaelis-Menten për të dyja praninë dhe mungesën e γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g-i) .4g-i). Në metilation DNMT1-mediated ADN, analiza Eadie-Hofstee tregoi se γ-oryzanol tregoi asnjë efekt në V max të formimit të SAH (automjet, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), ndërsa γ-oryzanol dukshëm rriti K m (automjet, 0.47 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Këto rezultate sugjerojnë se γ-oryzanol pengon DNMT1 të paktën pjesërisht në një mënyrë konkurruese. Nga ana tjetër, për methylation DNMT3a- dhe 3b-mediated ADN, γ-oryzanol ulur V max i formimit të SAH (DNMT3a: automjet, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: automjet, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-orzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) dhe, në mënyrë të ngjashme, K m për këtë reaksion (DNMT3a: automjet, 0.0086 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: automjet, 0.0122 μg / ml; γ- orizanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Këto rezultate sugjerojnë se γ-oryzanol pengon DNMT3a dhe 3b të paktën pjesërisht në një mënyrë jo-konkurruese.
γ-oryzanol rrit nivelet e D2R në striatum e minj HFD-ushqyer
Ne testuam më pas mundësinë që γ-oryzanol të rriste përmbajtjen striatum D2R përmes një ndalimi të DNMTs. Në minj HFD-ushqyer, administrimi oral i γ-oryzanol ulur ndjeshëm methylation striatal ADN në rajonin e promotor i D2Rs (Fig. (Fig.5a) 5a), ndërsa nuk e bëri këtë në hypothalamus (Fig. (Fig.5f) .5f). Në përputhje me këto gjetje, nivelet e ARNi dhe proteinave të D2R u rritën reciprokisht (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Ngjashëm me të dhënat për trajtimin me 5-aza-dC (Fig. (Fig.1) 1), nuk kishte efekte të dukshme në ARN dhe nivelet e proteinave të Drd1, Th Slc6a3 (DAT) në striatum, dhe nuk ka efekte në nivelet e Drd1, Th Slc6a3 në hypothalamus (Fig. (Fig.5c-e, 5c-e, h-k, m).
Studimet e mëparshme kanë treguar se nivelet e D2R dhe DNMT1 janë të rregulluara nga stresi ER dhe inflamacioni të paktën pjesërisht nëpërmjet NF-κB [17, 24, 25]. Prandaj, ne shqyrtuam nivelet e gjeneve të lidhur me stresin dhe inflamacionin. Siç është demonstruar më parë [26], HFD rritur shprehjen e gjeneve që kodojnë TNF-α (TFN -së), monociti chemoattractant protein-1 (MCP-1) (Ccl2), Proteina C / EBP homologe (pres), ER-lokalizuar DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) dhe formën e shkrirë të X-box-it që lidhet me proteinë 1 (Xbp1s) në hypothalamus, por jo në striatum (Fig. (Fig.6) .6). Veçanërisht, plotësimi i HFD me γ-oryzanol reduktoi ndjeshëm shprehjen e rritur të Ccl2, pres, Dnajb9 Xbp1s ekskluzivisht në hypothalamus, por jo në striatum (Fig. (Fig.66).
Diskutim
Përfundimi kryesor në studimin aktual është se γ-oryzanol vepron si një inhibitor i fuqishëm DNMT në striatumin e minjve, duke zbutur, të paktën pjesërisht, preferencën për një HFD nëpërmjet modulimit epigenetik të D2R striatum. Në striatum nga minjtë HFD-ushqyer, nivelet e D2R ishin ulur ndjeshëm, ndërsa ato të D1R, TH dhe DAT nuk u ndryshuan (Fig. (Fig.1b-e, 1b-e, k-m). Këto të dhëna janë në përputhje me nocionin se disregulimi i D2R striatal luan një rol kritik në perceptimin e shpërblimit të ushqimit kur në një HFD, duke çuar në overconfigurimin hedonik të HFD në kafshë të trashë [3]. Në studimin aktual, trajtimi i minjve të ushqyer me HFD me 5-aza-dC ka rritur ndjeshëm nivelet e D2R striatal (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) ndoshta përmes një reduktimi në nivelin e metilimit të ADN-së në rajonin e promotorit të D2R (Fig. (Fig.1a) 1a), dhe rrjedhimisht zbutën preferencën për yndyrën dietike (Fig. (Fig.1n) .1n). Ky konstatim gjithashtu mbështet një rol kritik të D2Rs striatal në perceptimin e shpërblimit të ushqimit kur në një HFD.
Testimi ynë in vitro tregoi se aktiviteti frenues i γ-orzzanolit kundrejt DNMTs ishte dukshëm më i fortë se ai i acidit të tij metabolitit ferulik (Fig. (Fig.4d-f) 4d-f), duke sugjeruar rëndësinë e strukturës së plotë të γ-oryzanol për veprimin e saj frenues në DNMTs. Në minj të ushqyer me HFD, studimet tona sugjerojnë se, pas administrimit oral, γ-orizinol arrin tru si një strukturë e plotë dhe ul nivelet dhe aktivitetet e DNMTs në mënyrë preferenciale në striatum, me një ulje konsekuente të methylation DNA në rajonin promotor të D2R në striatum. Për më tepër, studimet tona in vitro kanë treguar se γ-oryzanol vepron si një antagonist i pjesshëm ndaj ERRγ, i cili kryesisht shërben si një rregullator pozitiv për prodhimin e DNMT1 [22], dhe rrjedhimisht ulur aktivitetin e DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3a). Nga vini re, ERRγ u shpreh shumë në striatum, por jo në hypothalamus në minj (Fig. (Fig.3b) .3b). Këto të dhëna sugjerojnë se γ-oryzanol ka potencialin për të ulur nivelin e ARNi të DNMT1, të paktën pjesërisht, nëpërmjet ndalimit të ERRγ. Në kontrast me striatum, γ-oryzanol nuk tregoi asnjë efekt në nivelin e D2R në hypothalamus nga minj HFD-ushqyer (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
Nga ana tjetër, ne kemi treguar se γ-oryzanol rritur ndjeshëm nivelet e DNMT1 në hypothalamus, por jo në striatum (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Është treguar se STAT3 rrit përmbajtjen e DNMT1 në qelizat T malinje të limfomës [23]. Veçanërisht, ne kemi treguar më parë se γ-oryzanol rritur në mënyrë të konsiderueshme phosphorylation STAT3 induktuar leptin në hypothalamus nga minj HFD-ushqyer [14]. Duhet gjithashtu të theksohet se STAT3α u shpreh kryesisht në hypothalamus, por jo në striatum në minj (Fig. (Fig.3e-g) .3e-g). Këto të dhëna na provokojnë që të spekulojmë se ndryshimi i dukshëm në efekt të γ-orzzanolit në nivelet e DNMT1 ndërmjet hypothalamus dhe striatum mund të atribuohet, të paktën pjesërisht, në përmbajtjen specifike të rajonit të STAT3α dhe ERRγ në tru të minjve ( Fik. (Fig.3b-g) .3b-g). Kolektivisht, duket të ketë një model reciprok të shprehjes së ERRγ dhe STAT3α midis striatumit dhe hypothalamus në minj. Në bazë të rezultateve tona, është e arsyeshme të spekulohet se në striatum, ku prodhimi ERRγ është i bollshëm, γ-oryzanol mund të ulë preferencën nivelin e ARNi dhe aktivitetin enzimatik të DNMT1 si një rregullator negativ i ERRγ. Në të kundërt, në hypothalamus, ku prodhimi STAT3α është dominant, γ-oryzanol mund të preferojnë të rrisin nivelet e DNMT1.
Një studim i kohëve të fundit tregoi se një zbutje e sinjalizimit striatal D2R të nxitur nga një HFD rregullon sjelljen e ushqyerjes [3], duke sugjeruar rëndësinë e mundshme të frenimit të DNMT striatal për trajtimin e obezitetit. Nga ana tjetër, një studim i mëparshëm tregoi një mundësi që statusi i metilimit të ADN-së të gjenit 4 të receptorit melanokortin të shprehur në bërthama specifike hipotalamike mund të modulojë format transgenerative të obezitetit në agouti të egra të verdhë [27]. Megjithëse studime të mëtejshme janë të garantuara për të sqaruar mekanizmat bazë, këto studime sugjerojnë rëndësinë e metilimit të ADN-së të indeve, gjeneve dhe sekuencave në patofiziologjinë e obezitetit të indukuar nga HFD.
Kohët e fundit kemi raportuar se HFD ka rritur nivelin e D2R në ishujt e pankreasit të minjve [17, 24]. Ka të ngjarë që një shtim i tillë të ndërmjetësohet, të paktën pjesërisht, nga stresi dhe inflamacioni i ER nëpërmjet NF-κB, sepse ka disa elementë reagues NF-κB në rajonin e promotorit të D2R [17, 24]. Për më tepër, një studim i kohëve të fundit ka treguar se TNF-α dhe IL-1β rritin nivelin dhe aktivitetin e DNMT1 në indet dhjamore nga minjtë e ushqyer me HFD [25]. E rëndësishmja, studimi i tanishëm tregoi se HFD nxiti stresin ER dhe inflamacionin preferencialisht në hypothalamus, por jo në striatum (Fig. (Fig.6) .6). Mekanizmat e thellë të metilizimit dhe demetilimit të ADN-së të indeksit, rajonit dhe të vendit, në paradigmën tonë eksperimentale duhet të presin hetime të mëtejshme.
Së bashku me raportin tonë të mëparshëm që tregon se γ-oryzanol zbut preferencën për një HFD nëpërmjet rregullimit hypothalamic të stresit ER në minj [14], γ-oryzanol gjithashtu përfaqëson një pronë unike të përmirësimit të disonukimit hedonik dhe metabolik të sjelljes së të ushqyerit. Për shkak se disa ilaçe anti-obeziteti që janë zhvilluar, dihen të shkaktojnë efekte kritike negative [8], një qasje natyrore bazuar në ushqime ndaj sistemit të shpërblimit të trurit parashikohet të trajtojë shëndetin e diabetit të obezitetit [16]. Në këtë paradigmë, γ-oryzanol është një kandidat premtues antiobesiteti me një pronë të dallueshme të të qënit një modulator epigenetik.
Mirënjohje
Ne jemi mirënjohës ndaj S. Okamoto (Universiteti i Ryukyus, Japoni) për shqyrtimin e dorëshkrimit. Falënderojmë M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato dhe C. Noguchi (Universiteti i Ryukyus, Japoni) për ndihmën e sekretarisë.
Shkurtesat
| 5-aza-DC | 5-aza-2'-deoksicitidinë |
| D1R | Receptor Dopamine D1 |
| D2R | Receptor Dopamine D2 |
| DAT | Transporter Dopamine |
| DNMT | ADN-metiltransferazë |
| ER | Retikulumin endoplazmatik |
| ERR | Receptori i lidhur me estrogjenin |
| HFD | Dietë me yndyrë të lartë |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocysteine |
| SAM | S- Metioninë adenosil |
| STAT3α | Dhënës sinjal dhe aktivues i transkriptimit 3α |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
Shënimet
Disponueshmëria e të dhënave
Grupet e të dhënave të krijuara dhe / ose të analizuara gjatë studimit të tanishëm janë në dispozicion nga autori përkatës me kërkesa të arsyeshme.
Financimi
Kjo punë u mbështet në pjesë nga Grants-in-Aid nga Shoqëria Japoneze për Promovimin e Shkencës (JSPS, KAKENHI Grant Numbers 15K19520 dhe 24591338), Këshilli për Shkencën, Teknologjinë dhe Inovacionin (CSTI), Programi për Promovimin Strategjik Ndër-Ministror të Inovacionit Strategjik (SIP) "Teknologjitë për krijimin e gjeneratës së ardhshme të bujqësisë, pylltarisë dhe peshkimit", Fondacioni Lotte, Fondacioni Japonez për Enzimatologji të Aplikuar, Organizata për Zhvillimin e Energjisë së Re dhe Teknologjisë Industriale (NEDO), Projekti për Formimin e Rrjetit të Shkencës Jetësore Japonia) dhe Projekti i Promovimit të Klasterizimit Mjekësor të Prefekturës Okinawa, Japoni, së bashku me një grant nga Prefektura Okinawa për promovimin e mjekësisë së avancuar (Prefektura Okinawa, Japoni).
Dualiteti i interesit
Autorët deklarojnë se nuk ka dualizëm interesi lidhur me këtë dorëshkrim.
Deklarata e kontributit
CK dhe HM projektuan hulumtimin. CK dhe TK kryen eksperimentet dhe analizuan të dhënat. TK, CS-O, CT, MT, MM dhe KA kontribuan në interpretimin e të dhënave. CK dhe HM shkroi dorëshkrimin. Të gjithë autorët kontribuan në interpretimin e të dhënave. Të gjithë autorët u bashkuan në rishikimin e dorëshkrimit dhe miratuan versionin e tij përfundimtar. HM është garantues i kësaj pune, ka qasje të plotë në të gjitha të dhënat dhe merr përgjegjësinë e plotë për integritetin e të dhënave dhe saktësinë e analizës së të dhënave.
Shënimet
Materiale plotësuese elektronike
Versioni online i këtij artikulli (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) përmban material shtesë shtesë të shqyrtuar, por të paautorizuar, i cili është në dispozicion të përdoruesve të autorizuar.
Referencat
;